Иммуномодуляциялық метаболиттер ісік микроортасының (TME) негізгі ерекшелігі болып табылады, бірақ бірнеше ерекшеліктерді қоспағанда, олардың жеке басы белгісіз болып қала береді. Мұнда біз жоғары дәрежелі серозды карциномасы (HGSC) бар науқастардың ісіктері мен асциттерінен алынған ісіктер мен Т жасушаларын талдап, осы әртүрлі TME бөлімдерінің метаболомын анықтадық. Асцит пен ісік жасушаларының метаболиттік айырмашылықтары кең. Асцитпен салыстырғанда, ісікке енетін Т жасушалары 1-метилникотинамидке (MNA) айтарлықтай бай. Т жасушаларындағы MNA деңгейі жоғары болғанымен, никотинамид N-метилтрансферазасының (S-аденозилметиониннен никотинамидке метил топтарының ауысуын катализдейтін фермент) экспрессиясы фибробласттар мен ісік жасушаларымен шектеледі. Функционалды түрде MNA Т жасушаларын ісікке ықпал ететін цитокин ісік некрозының альфа факторын бөлуге итермелейді. Сондықтан, TME-ден алынған MNA Т жасушаларының иммундық реттелуіне ықпал етеді және адам қатерлі ісігін емдеу үшін әлеуетті иммунотерапия нысанасын білдіреді.
Ісіктен алынған метаболиттер ісікке қарсы иммунитетке терең тежегіш әсер етуі мүмкін, және олардың аурудың өршуінің негізгі қозғаушы күші бола алатынын дәлелдейтін дәлелдер көбейіп келеді (1). Варбург әсерінен басқа, ісік жасушаларының метаболикалық күйін және оның ісік микроортасының (TME) иммундық күйімен байланысын сипаттау бойынша жақында жүргізілген жұмыстар басталды. Тышқан модельдері мен адамның Т жасушалары бойынша жүргізілген зерттеулер глутамин метаболизмінің (2), тотығу метаболизмінің (3) және глюкоза метаболизмінің (4) әртүрлі иммундық жасуша кіші топтарына тәуелсіз әсер ете алатынын көрсетті. Бұл жолдардағы бірнеше метаболиттер Т жасушаларының ісікке қарсы функциясын тежейді. Тетрагидробиоптерин (BH4) коферментінің блокадасы Т жасушаларының көбеюіне зиян келтіруі мүмкін екендігі және организмде BH4 жоғарылауы CD4 және CD8 арқылы жүзеге асырылатын ісікке қарсы иммундық жауапты күшейтуі мүмкін екендігі дәлелденді. Сонымен қатар, кинурениннің иммуносупрессивті әсерін BH4 енгізу арқылы құтқаруға болады (5). Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутантты глиобластомасында энантиометаболикалық (R)-2-гидроксиглутараттың (R-2-HG) секрециясы Т-жасушаларының белсенділігін, пролиферациясын және цитолиз белсенділігін тежейді (6). Жақында гликолиздің жанама өнімі болып табылатын метилглиоксал миелоидты тектес супрессорлық жасушалармен өндірілетіні және метилглиоксалдың Т-жасушаларына ауысуы эффекторлық Т-жасушаларының қызметін тежеуі мүмкін екені көрсетілді. Емдеу кезінде метилглиоксалды бейтараптандыру миелоидты тектес супрессорлық жасушалардың (MDSC) белсенділігін жеңіп, тышқан модельдерінде бақылау нүктелерін блоктау терапиясын синергетикалық түрде күшейте алады (7). Бұл зерттеулер Т-жасушаларының қызметі мен белсенділігін реттеудегі ТМЭ-ден алынған метаболиттердің негізгі рөлін бірге атап көрсетеді.
Аналық без қатерлі ісігінде Т-жасушаларының дисфункциясы кеңінен хабарланған (8). Бұл ішінара гипоксияға және ісік тамырларының қалыптан тыс болуына байланысты (9), бұл глюкоза мен триптофанның сүт қышқылы және кинуренин сияқты қосалқы өнімдерге айналуына әкеледі. Жасушадан тыс лактаттың шамадан тыс мөлшері интерферон-γ (IFN-γ) өндірісін азайтады және миелосупрессивті кіші топтарының дифференциациясын тудырады (10, 11). Триптофанды тұтыну Т-жасушаларының пролиферациясын тікелей тежейді және Т-жасуша рецепторларының сигнал беруін тежейді (12-14). Осы бақылауларға қарамастан, иммундық метаболизмге қатысты көптеген жұмыс in vitro Т-жасуша дақылында оңтайландырылған ортаны пайдаланып жүргізілді немесе in vivo гомологиялық тышқан модельдерімен шектелді, олардың ешқайсысы адам қатерлі ісіктерінің гетерогенділігін және физиологиялық макро және микро ортаны толық көрсетпейді.
Аналық без қатерлі ісігінің жиі кездесетін белгісі - ішперденің таралуы және асциттің пайда болуы. Асцитте жасуша сұйықтығының жиналуы аурудың асқынуымен және нашар болжаммен байланысты (15). Есептерге сәйкес, бұл ерекше бөлім гипоксиялық, тамыр эндотелийінің өсу факторының (VEGF) және индоламин 2,3-диоксигеназаның (IDO) жоғары деңгейіне ие және Т-реттеуші жасушалар мен миелоидты тежегіш жасушалармен инфильтрацияланады (15-18). Асциттің метаболикалық ортасы ісіктің өзінен өзгеше болуы мүмкін, сондықтан ішперде кеңістігіндегі Т-жасушаларының қайта бағдарламалануы түсініксіз. Сонымен қатар, ісік ортасында болатын асцит пен метаболиттер арасындағы негізгі айырмашылықтар мен гетерогенділік иммундық жасушалардың енуіне және олардың ісіктердегі қызметіне кедергі келтіруі мүмкін, сондықтан қосымша зерттеулер қажет.
Осы мәселелерді шешу үшін біз әртүрлі жасуша түрлерін (CD4+ және CD8+ Т жасушаларын қоса алғанда), сондай-ақ ісіктердің ішінде және арасында зерттеу үшін сезімтал жасушаларды бөлу және сұйық хроматографиялық тандемдік масс-спектрометрия (LC-MS/MS) әдісін әзірледік. Оның метаболиттері пациенттің асциттері мен ісік ортасындағы жасушаларды қамтиды. Біз бұл әдісті жоғары өлшемді ағынды цитометриямен және бір жасушалы РНҚ секвенирлеумен (scRNA-seq) бірге осы негізгі популяциялардың метаболикалық жағдайының жоғары ажыратымдылықтағы портретін ұсыну үшін қолданамыз. Бұл әдіс ісік Т жасушаларында 1-метилникотинамид (MNA) деңгейінің айтарлықтай артуын анықтады, ал in vitro тәжірибелер MNA-ның Т жасушаларының қызметіне иммуномодуляциялық әсері бұрын белгісіз болғанын көрсетті. Жалпы, бұл әдіс ісіктер мен иммундық жасушалар арасындағы өзара метаболикалық өзара әрекеттесуді анықтайды және иммундық реттеу метаболиттері туралы бірегей түсінік береді, бұл Т жасушаларына негізделген аналық без қатерлі ісігінің иммунотерапиясын емдеу мүмкіндіктері үшін пайдалы болуы мүмкін.
Біз глюкозаның сіңуін бір мезгілде сандық бағалау үшін жоғары өлшемді ағынды цитометрияны қолдандық [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амин)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) және митохондриялық белсенділік [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) иммундық жасушалар мен ісік жасушаларының популяцияларын ажырататын қатар жүретін типтік маркерлер болып табылады (S2 кестесі және S1A суреті). Бұл талдау Т жасушаларымен салыстырғанда асцит пен ісік жасушаларының глюкозаның сіңу деңгейі жоғары екенін, бірақ митохондриялық белсенділікте айырмашылықтары аз екенін көрсетті. Ісік жасушаларының [CD45-EpCAM (EpCAM)+] орташа глюкозаның сіңуі Т жасушаларынан үш-төрт есе, ал CD4 + Т жасушаларының орташа глюкозаның сіңуі CD8 + Т жасушаларынан 1,2 есе жоғары, бұл ісікке инфильтрацияланатын лимфоциттердің (TIL) бірдей TME-де де әртүрлі метаболикалық қажеттіліктері бар екенін көрсетеді (1A сурет). Керісінше, ісік жасушаларындағы митохондриялық белсенділік CD4 + T жасушаларына ұқсас, ал екі жасуша түрінің митохондриялық белсенділігі CD8 + T жасушаларына қарағанда жоғары (1B сурет). Жалпы, бұл нәтижелер метаболикалық деңгейді көрсетеді. Ісік жасушаларының метаболикалық белсенділігі CD4 + T жасушаларына қарағанда жоғары, ал CD4 + T жасушаларының метаболикалық белсенділігі CD8 + T жасушаларына қарағанда жоғары. Жасуша түрлері бойынша осы әсерлерге қарамастан, CD4 + және CD8 + T жасушаларының метаболикалық күйінде немесе асциттегі ісіктермен салыстырғандағы салыстырмалы пропорцияларында тұрақты айырмашылық жоқ (1C сурет). Керісінше, CD45-жасуша фракциясында ісіктегі EpCAM+ жасушаларының үлесі асцитпен салыстырғанда артты (1D сурет). Сондай-ақ, EpCAM+ және EpCAM-жасуша компоненттері арасында айқын метаболикалық айырмашылықты байқадық. EpCAM+ (ісік) жасушаларында EpCAM-жасушаларына қарағанда глюкозаның сіңуі және митохондриялық белсенділік жоғары, бұл TME ісік жасушаларындағы фибробласттардың метаболикалық белсенділігінен әлдеқайда жоғары (1, E және F сурет).
(A және B) Глюкозаның сіңуінің (2-NBDG) орташа флуоресценция қарқындылығы (MFI) (A) және CD4 + Т жасушаларының митохондриялық белсенділігі (MitoTracker қою қызыл) (B) Асцит пен ісіктен алынған CD8 + Т жасушалары мен EpCAM + CD45-ісік жасушаларының типтік графиктері (сол жақта) және кестелік деректер (оң жақта), асцит пен ісіктен алынған CD8 + Т жасушалары мен EpCAM + CD45-ісік жасушалары. (C) Асцит пен ісіктегі CD4 + және CD8 + жасушаларының (CD3 + Т жасушаларының) қатынасы. (D) Асцит пен ісіктегі (CD45−) EpCAM + ісік жасушаларының үлесі. (E және F) EpCAM + CD45-ісік және EpCAM-CD45-матрица глюкозаның сіңуі (2-NBDG) (E) және митохондриялық белсенділік (MitoTracker қою қызыл) (F) типтік графиктер (сол жақта) және кестелік деректер (Оң жақта) Асциттер мен ісік жасушалары. (G) Ағынды цитометрия арқылы CD25, CD137 және PD1 экспрессиясының типтік графиктері. (H және I) CD4 + Т жасушаларындағы (H) және CD8 + Т жасушаларындағы (I) CD25, CD137 және PD1 экспрессиясы. (J және K) CCR7 және CD45RO экспрессиясына негізделген наив, орталық жады (Tcm), эффекторлық (Teff) және эффекторлық жады (Tem) фенотиптері. Асцит пен ісіктердегі CD4 + Т жасушаларының (J) және CD8 + Т жасушаларының (K) репрезентативтік кескіндері (сол жақта) және кестелік деректер (оң жақта). P мәндері жұптасқан t-тест арқылы анықталады (*P<0.05, **P<0.01 және ***P<0.001). Сызық сәйкес келетін пациенттерді білдіреді (n = 6). FMO, флуоресценция минус бір; MFI, флуоресценцияның орташа қарқындылығы.
Әрі қарай талдау жоғары деңгейде шешілген Т-жасушаларының фенотиптік мәртебесі арасындағы басқа да маңызды айырмашылықтарды анықтады. Ісіктердегі белсендірілген (1-сурет, G-ден I-ге дейін) және эффекторлық жад (1-сурет, J және K) асцитке (CD3 + Т жасушаларының үлесіне) қарағанда әлдеқайда жиі кездеседі. Сол сияқты, белсендіру маркерлерінің (CD25 және CD137) және сарқылу маркерлерінің [бағдарламаланған жасуша өлімі ақуызы 1 (PD1)] экспрессиясы бойынша фенотипті талдау бұл популяциялардың метаболикалық сипаттамалары әртүрлі болғанымен (S1, B-ден E-ге дейін), бірақ наив, эффекторлық немесе жад ішкі жиынтықтары арасында ешқандай маңызды метаболикалық айырмашылықтар байқалмағанын көрсетті (S1, F-тен I-ге дейін). Бұл нәтижелер жасуша фенотиптерін автоматты түрде тағайындау үшін машиналық оқыту әдістерін қолдану арқылы расталды (21), бұл пациенттің асцитінде көптеген сүйек кемігі жасушаларының (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) бар екенін анықтады (S2A-сурет). Барлық анықталған жасуша түрлерінің ішінде бұл миелоидты жасуша популяциясы глюкозаның ең жоғары сіңуін және митохондриялық белсенділікті көрсетті (S2 сурет, B-дан G-ге дейін). Бұл нәтижелер HGSC науқастарындағы асцит пен ісіктерде кездесетін бірнеше жасуша түрлері арасындағы күшті метаболикалық айырмашылықтарды көрсетеді.
TIL метабономиялық сипаттамаларын түсінудегі негізгі қиындық - ісіктерден жеткілікті тазалықтағы, сапалықтағы және мөлшердегі Т жасушаларының үлгілерін бөліп алу қажеттілігі. Жақында жүргізілген зерттеулер ағынды цитометрияға негізделген сұрыптау және моншақтарды байыту әдістері жасушалық метаболит профильдерінің өзгеруіне әкелуі мүмкін екенін көрсетті (22-24). Бұл мәселені шешу үшін біз LC-MS/MS арқылы талдау алдында хирургиялық жолмен алынған адам аналық безі қатерлі ісігінен TIL бөліп алу және оқшаулау үшін моншақтарды байыту әдісін оңтайландырдық (Материалдар мен әдістерді қараңыз; 2A сурет). Бұл хаттаманың метаболиттердің өзгеруіне жалпы әсерін бағалау үшін біз жоғарыда аталған моншақтарды бөлу кезеңінен кейін сау донорлар белсендірген Т жасушаларының метаболит профильдерін моншақтарды бөлмеген, бірақ мұзда қалған жасушалармен салыстырдық. Бұл сапаны бақылау талдауы бұл екі жағдай арасында жоғары корреляция бар екенін (r = 0,77) және 86 метаболит тобының техникалық қайталануы жоғары қайталануға ие екенін анықтады (2B сурет). Сондықтан, бұл әдістер жасуша түрін байытудан өтіп жатқан жасушаларда метаболиттерді дәл талдауды жүргізе алады, осылайша HGSC-дегі нақты метаболиттерді анықтауға арналған алғашқы жоғары ажыратымдылықтағы платформаны қамтамасыз етеді, осылайша адамдарға жасушаның жыныстық метаболизм бағдарламасын тереңірек түсінуге мүмкіндік береді.
(A) Магниттік моншақтарды байытудың схемалық диаграммасы. LC-MS/MS арқылы талдау жасамас бұрын, жасушалар магниттік моншақтарды байытудың үш кезеңін қатарынан өткізеді немесе мұзда қалады. (B) Байыту түрінің метаболиттердің көптігіне әсері. Әрбір байыту түрі үшін үш өлшеудің орташа мәні ± SE. Сұр сызық 1:1 қатынасын білдіреді. Осьтік белгіде көрсетілген қайталанатын өлшеулердің класішілік корреляциясы (ICC). NAD, никотинамид аденин динуклеотиді. (C) Пациент метаболиттерін талдау жұмыс процесінің схемалық диаграммасы. Асциттер немесе ісіктер пациенттерден жиналып, криоконсервацияланады. Әрбір үлгінің аз бөлігі ағынды цитометрия арқылы талданды, ал қалған үлгілер CD4+, CD8+ және CD45- жасушалары үшін үш кезеңнен өтті. Бұл жасуша фракциялары LC-MS/MS көмегімен талданды. (D) Стандартталған метаболиттердің көптігінің жылу картасы. Дендрограмма үлгілер арасындағы Евклидтік қашықтықтардың Уорд кластерін білдіреді. (E) Үлгі метаболит картасының негізгі компоненттік талдауы (PCA), әр үлгінің үш қайталануын көрсетеді, сол пациенттен алынған үлгілер сызық арқылы қосылған. (F) Науқасқа байланысты үлгінің метаболиттік профилінің PCA (яғни, ішінара артықшылықты пайдалану); үлгі түрі дөңес қабықпен шектелген. PC1, негізгі компонент 1; PC2, негізгі компонент 2.
Әрі қарай, біз осы байыту әдісін алты HGSC пациентінің бастапқы асциттері мен ісіктеріндегі CD4+, CD8+ және CD45-жасуша фракцияларындағы 99 метаболитті талдау үшін қолдандық (2C сурет, S3A суреті және S3 және S4 кестелері). Қызығушылық тудыратын популяция тірі жасушалардың бастапқы үлкен үлгісінің 2%-дан 70%-ға дейінін құрайды, ал жасушалардың үлесі пациенттер арасында айтарлықтай өзгереді. Моншақтарды бөлгеннен кейін, қызығушылық тудыратын байытылған фракция (CD4+, CD8+ немесе CD45-) үлгідегі барлық тірі жасушалардың орташа есеппен 85%-дан астамын құрайды. Бұл байыту әдісі бізге адам ісік тіндерінің метаболизмінен жасуша популяцияларын талдауға мүмкіндік береді, мұны үлкен үлгілерден жасау мүмкін емес. Осы хаттаманы пайдаланып, біз l-кинуренин және аденозин, бұл екі жақсы сипатталған иммуносупрессивті метаболиттердің ісік Т жасушаларында немесе ісік жасушаларында жоғарылағанын анықтадық (S3, B және C суреттері). Сондықтан, бұл нәтижелер пациент тіндерінде биологиялық маңызды метаболиттерді табу үшін біздің жасушаларды бөлу және масс-спектрометрия технологиямыздың дәлдігі мен қабілетін көрсетеді.
Біздің талдауымыз сонымен қатар пациенттер ішінде және олардың арасында жасуша түрлерінің метаболикалық бөлінуінің күшті екенін анықтады (2D суреті және S4A суреті). Атап айтқанда, басқа пациенттермен салыстырғанда, 70 пациент әртүрлі метаболикалық сипаттамаларды көрсетті (2E суреті және S4B суреті), бұл пациенттер арасында айтарлықтай метаболикалық гетерогенділік болуы мүмкін екенін көрсетеді. Басқа пациенттермен салыстырғанда (1,2-ден 2 литрге дейін; S1 кестесі), 70 пациентте жиналған асциттің жалпы мөлшері (80 мл) аз болғанын атап өткен жөн. Негізгі компонентті талдау кезінде пациенттер арасындағы гетерогенділікті бақылау (мысалы, ішінара артықшылықты талдауды қолдану) жасуша түрлері арасындағы тұрақты өзгерістерді көрсетеді, ал жасуша түрлері және/немесе микроортасы метаболит профиліне сәйкес анық жинақталған (2F суреті). Жеке метаболиттерді талдау бұл әсерлерді атап өтті және жасуша түрлері мен микроортасы арасындағы айтарлықтай айырмашылықтарды анықтады. Айта кету керек, байқалған ең үлкен айырмашылық MNA болып табылады, ол әдетте CD45 жасушаларында және ісікке енетін CD4+ және CD8+ жасушаларында байытылған (3A сурет). CD4+ жасушалары үшін бұл әсер ең айқын көрінеді, және CD8+ жасушаларындағы MNA қоршаған ортаға қатты әсер ететін сияқты. Дегенмен, бұл маңызды емес, себебі алты пациенттің тек үшеуі ғана ісік CD8+ ұпайлары бойынша бағалануы мүмкін. MNA-дан басқа, асцит пен ісіктердегі әртүрлі жасушаларда TIL-де нашар сипатталатын басқа метаболиттер де әртүрлі бай (S3 және S4 суреттер). Сондықтан, бұл деректер әрі қарай зерттеу үшін иммуномодуляциялық метаболиттердің перспективалы жиынтығын ашады.
(A) Асцит пен ісіктен алынған CD4+, CD8+ және CD45- жасушаларындағы MNA нормаланған мөлшері. Қорап диаграммасында медиана (сызық), квартиль аралық диапазон (рамалық топса) және деректер диапазоны квартиль аралық диапазоннан (рамалық мұрт) 1,5 есеге дейін көрсетілген. «Пациент материалдары мен әдістері» бөлімінде сипатталғандай, P мәнін анықтау үшін пациенттің лимма мәнін пайдаланыңыз (*P<0,05 және **P<0,01). (B) MNA метаболизмінің схемалық диаграммасы (60). Метаболиттер: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибозасы; NMN, никотинамид мононуклеотиді. Ферменттер (жасыл): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуиндер; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид мононуклеотид аденилаттрансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилазасы. (C) асцит (сұр) және ісіктің scRNA-секвенциясының t-SNE (қызыл; n = 3 пациент). (D) scRNA-секвенциясын пайдаланып анықталған әртүрлі жасуша популяцияларындағы NNMT экспрессиясы. (E) SK-OV-3, адам эмбриондық бүйрегінің (HEK) 293T, Т жасушаларында және MNA-мен өңделген Т жасушаларында NNMT және AOX1 экспрессиясы. Бүктелген экспрессия SK-OV-3-ке қатысты көрсетілген. SEM экспрессиясының үлгісі көрсетілген (n = 6 сау донор). 35-тен жоғары Ct мәндері анықталмайды деп саналады (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, Т жасушаларында және 8 мМ MNA-мен өңделген Т жасушаларында SLC22A1 және SLC22A2 экспрессиясы. Бүктелген экспрессия SK-OV-3-ке қатысты көрсетілген. SEM-мен экспрессия үлгісі көрсетілген (n = 6 сау донор). 35-тен жоғары Ct мәндері анықталмайды деп саналады (UD). (G) MNA-мен 72 сағат инкубациядан кейін белсендірілген сау донор Т жасушаларындағы жасуша MNA мөлшері. SEM-мен экспрессия үлгісі көрсетілген (n = 4 сау донор).
MNA метил тобын S-аденозил-1-метиониннен (SAM) никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; 3B сурет) арқылы никотинамидке (NA) ауыстыру арқылы өндіріледі. NNMT әртүрлі адам қатерлі ісіктерінде шамадан тыс экспрессияланады және пролиферациямен, инвазиямен және метастазбен байланысты (25-27). TME-дегі Т жасушаларындағы MNA көзін жақсырақ түсіну үшін біз үш HGSC пациентінің асциттері мен ісіктеріндегі жасуша түрлері бойынша NNMT экспрессиясын сипаттау үшін scRNA-seq қолдандық (S5 кестесі). Шамамен 6500 жасушаны талдау асциттер мен ісік орталарында NNMT экспрессиясы болжамды фибробласттар мен ісік жасушаларының популяцияларымен шектелгенін көрсетті (3-сурет, C және D). PTPRC (CD45 +) экспрессиялайтын кез келген популяцияда айқын NNMT экспрессиясы жоқ екенін атап өткен жөн (3D сурет және S5A суреті), бұл метаболит спектрінде анықталған MNA Т жасушаларына енгізілгенін көрсетеді. Альдегид оксидазасы 1 (AOX1) экспрессиясы MNA-ны 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамидке (2-PYR) немесе 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамидке (4-PYR) айналдырады; 3B сурет) сонымен қатар COL1A1 экспрессиялайтын фибробласттар популяциясымен шектеледі (S5A сурет), бұл бірге Т жасушаларының дәстүрлі MNA метаболизмі қабілетінің жоқтығын көрсетеді. Бұл MNA-ға байланысты гендердің экспрессия үлгісі HGSC пациенттерінің асциттерінен алынған екінші тәуелсіз жасуша деректер жиынтығын пайдаланып тексерілді (S5B сурет; n = 6) (16). Сонымен қатар, MNA-мен емделген сау донорлық Т жасушаларының сандық полимеразды тізбекті реакция (qPCR) талдауы бақылау SK-OV-3 аналық без ісігі жасушаларымен салыстырғанда NNMT немесе AOX1 экспрессияланбағанын көрсетті (3E сурет). Бұл күтпеген нәтижелер MNA фибробласттардан немесе ісіктерден TME-дегі көршілес Т жасушаларына бөлінуі мүмкін екенін көрсетеді.
Кандидаттар еритін тасымалдаушы 22 (SLC22) тұқымдасымен (SLC22A1, SLC22A2 және SLC22A3) кодталған 1-ден 3-ке дейінгі органикалық катион тасымалдаушыларының тұқымдасын (OCT1, OCT2 және OCT3) қамтығанымен, MNA әлеуетті тасымалдаушылары әлі анықталмаған (28). Сау донор Т жасушаларынан алынған мРНҚ-ның QPCR көрсеткіші SLC22A1 экспрессиясының төмен деңгейін көрсетті, бірақ SLC22A2 анықталмайтын деңгейлерін көрсетті, бұл оның бұрын әдебиетте хабарланғанын растады (3F сурет) (29). Керісінше, SK-OV-3 аналық без ісігі жасуша желісі екі тасымалдаушының да жоғары деңгейін көрсетті (3F сурет).
Т жасушаларының бөгде MNA сіңіру мүмкіндігін тексеру үшін сау донор Т жасушалары MNA-ның әртүрлі концентрациялары болған кезде 72 сағат бойы өсірілді. Экзогендік MNA болмаған кезде MNA жасушалық құрамын анықтау мүмкін емес (3G-сурет). Дегенмен, экзогендік MNA-мен өңделген белсендірілген Т жасушалары жасушалардағы MNA құрамының дозаға тәуелді түрде 6 мМ MNA-ға дейін артуын көрсетті (3G-сурет). Бұл нәтиже тасымалдаушы экспрессиясының төмен деңгейіне және жасушаішілік MNA метаболизміне жауапты негізгі ферменттің болмауына қарамастан, TIL әлі де MNA-ны сіңіре алатынын көрсетеді.
Пациенттердің Т жасушаларындағы метаболиттердің спектрі және in vitro MNA сіңіру эксперименттері қатерлі ісікпен байланысты фибробласттардың (CAF) MNA бөліп шығару мүмкіндігін арттырады, ал ісік жасушалары TIL фенотипі мен функциясын реттеуі мүмкін. MNA-ның Т жасушаларына әсерін анықтау үшін сау донорлық Т жасушалары in vitro MNA болған кезде немесе болмаған кезде белсендірілді, және олардың көбеюі мен цитокин өндірісі бағаланды. MNA-ны ең жоғары дозада қосқаннан кейін 7 күн өткен соң, популяцияның екі еселену саны орташа түрде азайды, ал белсенділік барлық дозаларда сақталды (4A сурет). Сонымен қатар, экзогендік MNA-ны емдеу ісік некрозының факторы-α экспрессиялайтын CD4+ және CD8+ T жасушаларының үлесінің артуына әкелді (TNFα; 4B сурет). Керісінше, IFN-γ жасушаішілік өндірісі CD4+ T жасушаларында айтарлықтай төмендеді, бірақ CD8+ T жасушаларында емес, және интерлейкин 2-де айтарлықтай өзгеріс болған жоқ (IL-2; 4-сурет, C және D). Сондықтан, осы MNA-мен өңделген Т-жасуша дақылдарынан алынған супернатанттардың ферментпен байланысқан иммуносорбенттік талдауы (ELISA) TNFα-ның айтарлықтай жоғарылауын, IFN-γ-ның төмендеуін және IL-2-нің өзгеріссіз қалғанын көрсетті (4-сурет, E-ден G-ге дейін). . IFN-γ-ның төмендеуі MNA Т-жасушаларының ісікке қарсы белсенділігін тежеуде рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетеді. MNA-ның Т-жасушалары арқылы цитотоксикалық әсерге әсерін модельдеу үшін, жасыл флуоресцентті ақуыз (GFP) -CAR-T) жасушаларымен реттелетін фолий рецепторы α және CAR-T (GFP) нысанаға алатын химерлі антиген рецепторы T (FRα-CAR-T) жасушалары сау донорлық перифериялық қан мононуклеарлы жасушалары (PBMC) арқылы өндіріледі. CAR-T жасушалары MNA қатысуымен 24 сағат бойы өсірілді, содан кейін фолий рецепторы α экспрессиялайтын адамның SK-OV-3 аналық без ісігі жасушаларымен 10:1 эффектор мен нысанаға қатынасында бірге өсірілді. MNA емі FRα-CAR-T жасушаларының өлтіру белсенділігінің айтарлықтай төмендеуіне әкелді, бұл аденозинмен өңделген FRα-CAR-T жасушаларына ұқсас болды (4H сурет).
(A) 7-ші күні тікелей дақылдан алынған жалпы тіршілікке қабілетті жасушалар саны және популяцияның екі еселенуі (PD). Бағаналық диаграмма алты сау донордың орташа + SEM мәнін көрсетеді. Кем дегенде n = 3 тәуелсіз эксперименттерден алынған деректерді көрсетеді. (B-дан D-ға дейін) CD3/CD28 және IL-2 Т жасушаларын тиісті MNA концентрацияларында 7 күн бойы белсендіру үшін пайдаланылды. Талдау алдында жасушалар GolgiStop көмегімен PMA/иономицинмен 4 сағат бойы ынталандырылды. Т жасушаларындағы TNFα (B) экспрессиясы. Тірі жасушалардағы TNFα экспрессиясының мысал суреті (сол жақта) және кестелік деректері (оң жақта). Т жасушаларындағы IFN-γ (C) және IL-2 (D) экспрессиясы. Цитокиндердің экспрессиясы ағындық цитометрия арқылы өлшенді. Бағаналық диаграмма орташа (n = 6 сау донор) + SEM мәнін көрсетеді. P мәнін анықтау үшін дисперсияның бір жақты талдауын және қайталанатын өлшемдерді (*P<0,05 және **P<0,01) пайдаланыңыз. Кем дегенде n = 3 тәуелсіз эксперименттерден алынған деректерді көрсетеді. (E-ден G-ге дейін) CD3/CD28 және IL-2 Т жасушаларын тиісті MNA концентрацияларында 7 күн бойы белсендіру үшін пайдаланылды. Орта PMA/иономицин стимуляциясының 4 сағатына дейін және одан кейін жиналды. TNFα (E), IFN-γ (F) және IL-2 (G) концентрациялары ELISA арқылы өлшенді. Бағаналық график орташа мәнді (n = 5 сау донор) + SEM көрсетеді. P мәні дисперсияның бір жақты талдауы және қайталанатын өлшеулер арқылы анықталды (*P<0,05). Нүктелі сызық анықтаудың анықтау шегін көрсетеді. (H) Жасуша лизисін талдау. FRα-CAR-T немесе GFP-CAR-T жасушалары 24 сағат бойы аденозинмен (250μM) немесе MNA (10 мМ) реттелді немесе өңделмеді (Ctrl). SK-OV-3 жасушаларының пайыздық өлімі өлшенді. P мәні Welch t сынағымен анықталды (*P<0,5 және **P<0,01).
MNA-тәуелді TNFα экспрессиясының реттелуін механикалық түсіну үшін MNA-мен өңделген Т жасушаларының TNFα мРНҚ-сындағы өзгерістер бағаланды (5A-сурет). MNA-мен өңделген сау донорлық Т жасушаларында TNFα транскрипция деңгейінің екі есеге артуы байқалды, бұл MNA-ның TNFα транскрипциялық реттелуіне тәуелді екенін көрсетеді. Бұл мүмкін реттеу механизмін зерттеу үшін TNFα-ны реттейтін екі белгілі транскрипция факторы, атап айтқанда белсендірілген Т жасушаларының ядролық факторы (NFAT) және спецификалық ақуыз 1 (Sp1), MNA-ның проксимальды TNFα промоторына байланысуына жауап ретінде бағаланды (30). TNFα промоторында бір жерде қабаттасатын 6 анықталған NFAT байланысу орны және 2 Sp1 байланысу орны бар [5'қаптан -55 базалық жұп (bp)] (30). Хроматин иммунопреципитациясы (ChIP) MNA-мен өңделген кезде Sp1-дің TNFα промоторына байланысуы үш есеге артқанын көрсетті. NFAT-тың қосылуы да артты және маңыздылығына жақындады (5B-сурет). Бұл деректер MNA-ның Sp1 транскрипциясы арқылы TNFα экспрессиясын және аз дәрежеде NFAT экспрессиясын реттейтінін көрсетеді.
(A) MNA-сыз өсірілген Т жасушаларымен салыстырғанда, MNA-мен өңделген Т жасушаларындағы TNFα экспрессиясының қатпарлы өзгерісі. SEM-мен экспрессия үлгісі көрсетілген (n = 5 сау донор). Кем дегенде n = 3 тәуелсіз эксперименттерден алынған деректерді білдіреді. (B) NFAT және Sp1 4 сағат бойы (Ctrl) және PMA/иономицин стимуляциясымен біріктірілгеннен кейін 8 мМ MNA-мен немесе онсыз өңделген Т жасушаларының TNFα промоторы. Иммуноглобулин G (IgG) және H3 иммунопреципитация үшін теріс және оң бақылау тобы ретінде пайдаланылды. ChIP сандық бағалауы MNA-мен өңделген жасушаларда Sp1 және NFAT-тың TNFα промоторына байланысуы бақылау тобымен салыстырғанда бірнеше есе өскенін көрсетті. Кем дегенде n = 3 тәуелсіз эксперименттерден алынған деректерді білдіреді. Бірнеше t-тесттермен анықталған P мәні (*** P <0.01). (C) HGSC асциттерімен салыстырғанда, Т жасушалары (цитотоксикалық емес) ісікте TNF экспрессиясының жоғарылауын көрсетті. Түстер әртүрлі пациенттерді білдіреді. Көрсетілген жасушалар кездейсоқ түрде 300-ге дейін іріктеліп алынды және артық тартуды шектеу үшін дірілдеді (** Padj = 0,0076). (D) Аналық без қатерлі ісігіне арналған MNA моделінің ұсынылуы. MNA ісік жасушаларында және TME фибробласттарында өндіріледі және Т жасушаларымен сіңіріледі. MNA Sp1-дің TNFα промоторымен байланысуын арттырады, бұл TNFα транскрипциясының және TNFα цитокиндерінің өндірілуінің артуына әкеледі. MNA сонымен қатар IFN-γ төмендеуіне әкеледі. Т жасушаларының функциясының тежелуі өлтіру қабілетінің төмендеуіне және ісіктің өсуінің жеделдеуіне әкеледі.
Хабарламаларға сәйкес, TNFα алдыңғы және артқы жағынан ісікке қарсы және ісікке қарсы әсерге ие, бірақ ол аналық без қатерлі ісігінің өсуі мен метастазын ынталандыруда белгілі рөл атқарады (31-33). Хабарламаларға сәйкес, аналық без қатерлі ісігімен ауыратын науқастарда асцит пен ісік тіндеріндегі TNFα концентрациясы қатерсіз тіндерге қарағанда жоғары (34-36). Механизм тұрғысынан TNFα лейкоциттердің белсенділігін, қызметін және көбеюін реттей алады және қатерлі ісік жасушаларының фенотипін өзгерте алады (37, 38). Осы зерттеулерге сәйкес, дифференциалды ген экспрессиясын талдау асцитпен салыстырғанда ісік тіндеріндегі Т жасушаларында TNF айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті (5C сурет). TNF экспрессиясының жоғарылауы тек цитотоксикалық емес фенотипі бар Т жасушаларының популяцияларында ғана байқалды (S5A сурет). Қысқаша айтқанда, бұл деректер MNA-ның HGSC-де қос иммуносупрессивті және ісікке ықпал ететін әсері бар деген пікірді растайды.
Ағынды цитометрияға негізделген флуоресцентті таңбалау TIL метаболизмін зерттеудің негізгі әдісіне айналды. Бұл зерттеулер перифериялық қан лимфоциттерімен немесе екінші реттік лимфоидты мүшелерден алынған Т жасушаларымен салыстырғанда, тышқандар мен адамның TIL глюкозаны сіңіруге бейімділігі жоғары екенін (4, 39) және митохондриялық функцияның біртіндеп жоғалуын (19, 40) көрсетті. Бұл зерттеуде ұқсас нәтижелерді байқағанымызбен, негізгі даму - ісік жасушаларының метаболизмін және сол резекцияланған ісік тінінен алынған TIL-ді салыстыру. Осы алдыңғы есептердің кейбіріне сәйкес, асцит пен ісіктерден алынған ісік (CD45-EpCAM +) жасушалары CD8 + және CD4 + T жасушаларына қарағанда глюкозаны жоғары сіңіреді, бұл ісік жасушаларының глюкозаны жоғары сіңіруін Т жасушаларымен салыстыруға болатынын растайды. Т жасушалары бәсекелестігінің тұжырымдамасы. TME. Дегенмен, ісік жасушаларының митохондриялық белсенділігі CD8 + T жасушаларына қарағанда жоғары, бірақ митохондриялық белсенділік CD4 + T жасушаларына ұқсас. Бұл нәтижелер тотығу метаболизмінің ісік жасушалары үшін маңызды екендігі туралы жаңа тақырыпты күшейтеді (41, 42). Олар сондай-ақ CD8 + T жасушалары CD4 + T жасушаларына қарағанда тотығу дисфункциясына бейім болуы мүмкін немесе CD4 + T жасушалары митохондриялық белсенділікті сақтау үшін глюкозадан басқа көміртегі көздерін пайдалануы мүмкін деп болжайды (43, 44). Асциттегі CD4 + T эффекторлары, Т эффекторлық жады және Т орталық жады жасушалары арасында глюкозаның сіңуінде немесе митохондриялық белсенділікте ешқандай айырмашылық байқалмағанын атап өткен жөн. Сол сияқты, ісіктердегі CD8 + T жасушаларының дифференциация күйі глюкозаның сіңуіндегі өзгерістермен ешқандай байланысы жоқ, бұл in vitro өсірілген Т жасушалары мен in vivo адам TIL арасындағы айтарлықтай айырмашылықты көрсетеді (22). Бұл бақылаулар жасуша популяциясының бейтарап автоматты бөлінуін қолдану арқылы да расталды, бұл ісік жасушаларына қарағанда глюкозаның сіңуі мен митохондриялық белсенділігі жоғары CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + жасушаларының басым екенін, бірақ метаболикалық белсенді жасуша популяциясына ие екенін көрсетті. Бұл популяция scRNA-seq талдауында анықталған миелоидты супрессор жасушаларының немесе плазмацитоидты дендриттік жасушалардың болжамды субпопуляциясын білдіруі мүмкін. Бұл екеуі де адамның аналық без ісіктерінде байқалғанымен [45], олар әлі де осы миелоидты субпопуляцияны сипаттауды қажет етеді.
Ағынды цитометрияға негізделген әдістер жасуша түрлері арасындағы глюкоза мен тотығу метаболизмінің жалпы айырмашылықтарын анықтай алса да, TME-дегі митохондриялық метаболизм үшін глюкоза немесе басқа көміртек көздерімен өндірілетін нақты метаболиттер әлі анықталған жоқ. Берілген TIL ішкі жиынына метаболиттердің болуын немесе болмауын тағайындау үшін жасуша популяциясын кесілген тіннен тазарту қажет. Сондықтан, біздің жасушаларды байыту әдісіміз масс-спектрометриямен біріктірілгенде, сәйкес келетін пациент үлгілеріндегі Т жасушалары мен ісік жасушаларының популяцияларында әр түрлі байытылған метаболиттер туралы түсінік бере алады. Бұл әдістің флуоресценциямен белсендірілген жасушаларды сұрыптауға қарағанда артықшылықтары болғанымен, белгілі бір метаболит кітапханаларына ішкі тұрақтылық және/немесе жылдам айналым жылдамдығына байланысты әсер етуі мүмкін (22). Соған қарамастан, біздің әдісіміз екі танылған иммуносупрессивті метаболиттерді, аденозин мен кинуренинді анықтай алды, себебі олар үлгі түрлері арасында айтарлықтай ерекшеленеді.
Ісіктер мен TIL кіші түрлерінің метабономикалық талдауы аналық бездің TME-дегі метаболиттердің рөлі туралы көбірек түсінік береді. Біріншіден, ағынды цитометрияны қолдана отырып, біз ісіктер мен CD4 + T жасушалары арасында митохондриялық белсенділікте ешқандай айырмашылық жоқ екенін анықтадық. Дегенмен, LC-MS/MS талдауы осы популяциялар арасындағы метаболиттердің көптігінде айтарлықтай өзгерістерді анықтады, бұл TIL метаболизмі және оның жалпы метаболикалық белсенділігі туралы қорытындыларды мұқият түсіндіруді қажет ететінін көрсетеді. Екіншіден, MNA - асциттегі CD45-жасушалары мен Т жасушалары арасындағы ең үлкен айырмашылыққа ие метаболит, ісіктерде емес. Сондықтан, бөлімдерге бөлу және ісіктің орналасуы TIL метаболизміне әртүрлі әсер етуі мүмкін, бұл берілген микроортада мүмкін болатын гетерогенділікті көрсетеді. Үшіншіден, MNA өндіретін NNMT ферментінің экспрессиясы негізінен CAF-пен шектеледі, ол аз дәрежеде ісік жасушалары болып табылады, бірақ ісіктен алынған Т жасушаларында анықталатын MNA деңгейлері байқалады. Аналық бездің CAF-тағы NNMT-нің шамадан тыс экспрессиясы белгілі бір қатерлі ісіктің дамуына ықпал етеді, ішінара CAF метаболизмінің, ісік инвазиясының және метастаздың жоғарылауына байланысты (27). TIL жалпы деңгейі орташа болғанымен, CAF-тағы NNMT экспрессиясы нашар болжаммен байланысты Cancer Genome Atlas (TCGA) мезенхималық кіші түрімен тығыз байланысты (27, 46, 47). Соңында, MNA ыдырауына жауапты AOX1 ферментінің экспрессиясы CAF популяциясымен шектеледі, бұл Т жасушаларының MNA метаболиздеу қабілетінің жоқтығын көрсетеді. Бұл нәтижелер бұл тұжырымды растау үшін қосымша жұмыс қажет болса да, Т жасушаларындағы MNA жоғары деңгейі иммуносупрессивті CAF микроортасының бар екенін көрсетуі мүмкін деген пікірді қолдайды.
MNA тасымалдаушыларының экспрессия деңгейінің төмендігі және MNA метаболизміне қатысатын негізгі ақуыздардың анықталмайтын деңгейлерін ескере отырып, Т жасушаларында MNA болуы күтпеген жағдай. NNMT де, AOX1 де scRNA-seq талдауы және екі тәуелсіз когортаның мақсатты qPCR арқылы анықталмады. Бұл нәтижелер MNA-ның Т жасушаларымен синтезделмейтінін, бірақ айналасындағы TME-ден сіңетінін көрсетеді. In vitro тәжірибелері Т жасушаларының экзогенді MNA жинақтауға бейім екенін көрсетеді.
Біздің in vitro зерттеулеріміз экзогендік MNA Т жасушаларында TNFα экспрессиясын индукциялайтынын және Sp1-дің TNFα промоторына байланысуын күшейтетінін көрсетті. TNFα ісікке қарсы және ісікке қарсы функцияларға ие болғанымен, аналық без қатерлі ісігінде TNFα аналық без қатерлі ісігінің өсуіне ықпал ете алады (31-33). Аналық без ісігі жасушаларының дақылында TNFα бейтараптандырылуы немесе тышқан модельдерінде TNFα сигналын жою TNFα арқылы қабыну цитокиндерінің өндірілуін жақсартып, ісіктің өсуін тежеуі мүмкін (32, 35). Сондықтан, бұл жағдайда TME-ден алынған MNA аутокриндік ілмек арқылы TNFα-тәуелді механизм арқылы қабынуға қарсы метаболит ретінде әрекет ете алады, осылайша аналық без қатерлі ісігінің пайда болуы мен таралуына ықпал етеді (31). Осы мүмкіндікке сүйене отырып, TNFα блокадасы аналық без қатерлі ісігінің әлеуетті терапиялық агенті ретінде зерттелуде (37, 48, 49). Сонымен қатар, MNA CAR-T жасушаларының аналық без ісік жасушаларына цитоуыттылығын бұзады, бұл MNA арқылы иммундық басудың қосымша дәлелдерін береді. Бұл нәтижелер жалпы алғанда ісіктер мен CAF жасушаларының MNA-ны жасушадан тыс TME-ге бөлетін моделін көрсетеді. (i) TNF-пен индукцияланған аналық без қатерлі ісігінің өсуін ынталандыру және (ii) MNA-мен индукцияланған Т-жасушаларының цитотоксикалық белсенділігін тежеу ​​​​арқылы бұл қос ісік әсеріне ие болуы мүмкін (5D сурет).
Қорытындылай келе, жасушаларды жылдам байыту, бір жасушалы секвенирлеу және метаболикалық профильдеудің үйлесімін қолдану арқылы бұл зерттеу HGSC пациенттеріндегі ісіктер мен асцит жасушалары арасындағы үлкен иммунометаболомиялық айырмашылықтарды анықтады. Бұл кешенді талдау Т жасушалары арасында глюкозаның сіңуінде және митохондриялық белсенділікте айырмашылықтар бар екенін көрсетті және MNA жасушалық емес автономды иммундық реттеуші метаболит ретінде анықталды. Бұл деректер TME адам қатерлі ісіктеріндегі Т жасушаларының метаболизміне қалай әсер ететініне әсер етеді. Т жасушалары мен қатерлі ісік жасушалары арасындағы қоректік заттар үшін тікелей бәсекелестік туралы хабарланғанымен, метаболиттер ісіктің дамуын ынталандыру және эндогендік иммундық реакцияларды басу үшін жанама реттеушілер ретінде де әрекет ете алады. Бұл реттеуші метаболиттердің функционалдық рөлін одан әрі сипаттау ісікке қарсы иммундық жауапты күшейтудің балама стратегияларын ашуы мүмкін.
Пациенттердің үлгілері мен клиникалық деректері Канадалық тіндер қоймасы желісімен сертификатталған Британ Колумбиясы қатерлі ісігі ісігі тіндерінің қоймасы арқылы алынды. Британ Колумбиясы қатерлі ісігін зерттеу этика комитеті және Британ Колумбиясы университеті бекіткен хаттамаға сәйкес (H07-00463), барлық пациенттердің үлгілері мен клиникалық деректері хабардар етілген жазбаша келісім алды немесе ресми түрде келісімінен бас тартты. Үлгілер сертификатталған BioBank-та (BRC-00290) сақталады. Пациенттің егжей-тегжейлі сипаттамалары S1 және S5 кестелерінде көрсетілген. Криоконсервациялау үшін скальпель пациенттің ісік үлгісін механикалық түрде ыдырату үшін қолданылады, содан кейін оны бір жасушалы суспензия алу үшін 100 микронды сүзгіден өткізеді. Пациенттің асциттері жасушаларды түйіршіктеу және үстіңгі қабатты алып тастау үшін 4°C температурада 1500 айн/мин жылдамдықпен 10 минут бойы центрифугаланды. Ісік пен асциттен алынған жасушалар 50% жылумен инактивтелген адам AB сарысуында (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) және 10% диметилсульфоксидте криоконсервацияланды. Бұл консервіленген бір жасушалы суспензиялар ерітіліп, төменде сипатталған метаболомика және метаболиттерді анықтау үшін пайдаланылды.
Толық орта 0,22 мкм сүзілген 50:50 RPMI 1640 қоспасынан тұрады: AimV. RPMI 1640 + 2,05 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific) 10% жылумен инактивтелген адам AB сарысуымен (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 x пенициллин стрептомицин (PenStrep) ерітіндісімен (Thermo Fisher Scientific) және 50 мкМ-меркаптоэтанолмен толықтырылған. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) және 2 мМ л-глутаминмен (Thermo Fisher Scientific) толықтырылған. Ағынды цитометр бояу буфері 3% жылумен инактивтелген AB адам сарысуымен (Sigma) толықтырылған 0,22 мкм сүзілген фосфат буферленген тұзды ерітіндіден (PBS; Invitrogen) тұрды. Жасушаны байыту буфері 0,22 мкм сүзілген PBS-тен тұрады және 0,5% жылумен инактивтелген адам AB сарысуымен (Sigma-Aldrich) толықтырылған.
37°C толық ортада жасушалар 10 нМ MT DR және 100 μM 2-NBDG ерітіндісімен 30 минут бойы боялды. Содан кейін жасушалар 4°C температурада 15 минут бойы eF506 тіршілікке қабілетті бояуымен боялды. Жасушаларды FC Block (eBioscience) және Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ерітіндісінде қайта ерітіңіз, ағынды цитометр бояу буферінде сұйылтыңыз (өндіруші нұсқауларына сәйкес) және бөлме температурасында 10 минут бойы инкубациялаңыз. Жасушаларды антиденелер жиынтығымен (S2 кестесі) 4°C температурада 20 минут бойы ағынды цитометрия бояу буферінде бояңыз. Талдау алдында жасушаларды ағынды цитометрия бояу буферінде (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) қайта ерітіңіз. Жасуша санының деректерін талдау үшін SpectroFlo және FlowJo V10 пайдаланыңыз, ал деректерді жасау үшін GraphPad Prism 8 пайдаланыңыз. 2-NBDG және MT DR орташа флуоресценция қарқындылығы (MFI) логарифмдік нормаланды, содан кейін сәйкес пациенттерді есепке алу үшін статистикалық талдау үшін жұптасқан t-тест қолданылды. Талдаудан 40-тан аз оқиғасы бар барлық популяцияларды алып тастаңыз; статистикалық талдау мен деректерді визуализациялау алдында кез келген теріс мәндер үшін 1 MFI мәнін енгізіңіз.
Жоғарыда аталған процесс панелінің қолмен басқару стратегиясын толықтыру үшін біз FlowJo-дағы өлі жасушаларды жойғаннан кейін жасушаларды популяцияға автоматты түрде тағайындау үшін пішінді шектеу ағашының (FAUST) (21) толық аннотациясын пайдаландық. Біз дұрыс емес орналастырылған (PD1+ және PD1 ісік жасушаларын біріктіру) және сақталған популяцияларды біріктіру үшін шығысты қолмен басқарамыз. Әрбір үлгіде орта есеппен 2%-дан астам жасушалар бар, барлығы 11 популяция.
PBMC-ді лейкоциттерді бөлу өнімдерінен (STEMCELL Technologies) бөлу үшін фиколл градиентті тығыздық центрифугасы қолданылды. CD8 + Т жасушалары PBMC-ден CD8 MicroBeads (Miltenyi) көмегімен бөлініп алынды және өндірушінің нұсқауларына сәйкес TransAct (Miltenyi) көмегімен толық ортада 2 апта бойы кеңейтілді. Жасушалар IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) бар толық ортада 5 күн тұрғызылды, содан кейін TransAct-пен қайта ынталандырылды. 7-ші күні өндірушінің нұсқауларына сәйкес, жасушаларды байыту үшін адам CD45 MicroBeads (Miltenyi) үш раунд қатарынан қолданылды. Жасушалар ағынды цитометрия талдауы үшін (жоғарыда сипатталғандай) бөлінді, ал бір миллион жасуша LC-MS/MS талдауы үшін үш рет бөлінді. Үлгілер төменде сипатталғандай LC-MS/MS арқылы өңделді. Біз жоғалған метаболиттің мәнін 1000 ион санымен бағаладық. Әрбір үлгі жалпы ион санымен (TIC) қалыпқа келтіріледі, логарифмдік түрлендіріледі және талдау алдында MetaboAnalystR бағдарламасында автоматты түрде қалыпқа келтіріледі.
Әрбір пациенттің бір жасушалы суспензиясы ерітіліп, 40 мкм сүзгіден толық ортаға сүзілді (жоғарыда сипатталғандай). Өндірушінің хаттамасына сәйкес, CD8+, CD4+ және CD45 жасушаларына арналған үлгілерді (мұзда) байыту үшін MicroBeads (Miltenyi) көмегімен магниттік моншақтарды бөлу арқылы оң таңдаудың үш қатарынан кезеңі қолданылды. Қысқасы, жасушалар жасушаларды байыту буферінде қайта суспензияланады (жоғарыда сипатталғандай) және есептеледі. Жасушалар адамның CD8 моншақтарымен, адамның CD4 моншақтарымен немесе адамның CD45 моншақтарымен (Miltenyi) 4°C температурада 15 минут инкубацияланды, содан кейін жасушаларды байыту буферімен жуылды. Үлгі LS бағанынан (Miltenyi) өткізіледі, ал оң және теріс фракциялар жиналады. Ұзақтығын азайту және жасушаларды қалпына келтіру қадамын барынша арттыру үшін CD8 фракциясы CD4+ байытудың екінші кезеңі үшін, ал CD4 фракциясы кейінгі CD45 байыту үшін қолданылады. Бөлу процесінде ерітіндіні мұзда ұстаңыз.
Метаболиттерді талдауға үлгілерді дайындау үшін жасушалар мұздай тұз ерітіндісімен бір рет жуылды, содан кейін әр үлгіге 1 мл 80% метанол қосылды, содан кейін шайқалып, сұйық азотта мұздатылды. Үлгілер үш мұздату-еріту цикліне ұшырады және 4°C температурада 15 минут бойы 14 000 айн/мин жылдамдықпен центрифугаланды. Метаболиттері бар үстіңгі қабат кепкенше буландырылды. Метаболиттер 50 мкл 0,03% құмырсқа қышқылында қайта ерітіліп, араластырылып, содан кейін қалдықтарды кетіру үшін центрифугаланды.
Метаболиттерді жоғарыда сипатталғандай бөліп алыңыз. Метаболомиканы зерттеу үшін супернатантты жоғары өнімді сұйық хроматография бөтелкесіне ауыстырыңыз. Топтық әсерлердің алдын алу үшін әрбір үлгіні бірдей жасуша санымен өңдеу үшін кездейсоқ өңдеу хаттамасын пайдаланыңыз. Біз бұрын AB SCIEX QTRAP 5500 үштік квадрупольді масс-спектрометрінде (50) жарияланған жаһандық метаболиттердің сапалық бағасын жүргіздік. Хроматографиялық талдау және шың аймағын интеграциялау MultiQuant 2.1 нұсқасы бағдарламалық жасақтамасын (Applied Biosystems SCIEX) пайдаланып жүргізілді.
Жоқ метаболит мәнін бағалау үшін 1000 ион саны пайдаланылды, ал әрбір үлгінің TIC-і үлгіні өңдеуден аспаптық талдау арқылы енгізілген өзгерістерді түзету үшін әрбір анықталған метаболиттің қалыпқа келтірілген шың аймағын есептеу үшін пайдаланылды. TIC қалыпқа келтірілгеннен кейін, логарифмдік түрлендіру және автоматты норма сызығын масштабтау үшін MetaboAnalystR(51) (әдепкі параметр) қолданылады. Біз үлгі түрлері арасындағы метаболом айырмашылықтарының барлау талдауын жүргізу үшін вегетариандық R пакеті бар PCA қолдандық және пациенттерді талдау үшін ішінара артықшылық талдауын қолдандық. Үлгілер арасындағы Евклид қашықтығын кластерлеу үшін жылу картасының дендрограммасын құру үшін Уорд әдісін қолданыңыз. Біз бүкіл жасуша түрі мен микроортасы бойынша дифференциалды мол метаболиттерді анықтау үшін стандартталған метаболиттердің көптігіне limma (52) қолдандық. Түсіндіруді жеңілдету үшін біз модельді көрсету үшін топтық орташа параметрді қолданамыз және микроортасы бар жасуша түрлерін әр топ ретінде қарастырамыз (n = 6 топ); Маңыздылық сынағы үшін біз әрбір метаболит үшін үш қайталанатын өлшеу жүргіздік. Жалған репликацияны болдырмау үшін пациент лимма дизайнында кедергі ретінде енгізілді. Әртүрлі пациенттер арасындағы метаболиттердің айырмашылықтарын тексеру үшін біз пациенттерді қамтитын лимма моделін белгіленген түрде түзеттік. Біз жасуша түрі мен Padj <0,05 микроортасының арасындағы алдын ала белгіленген контрасттың маңыздылығын хабарлаймыз (Бенджамини-Хохберг түзетуі).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% өміршеңдік) көмегімен байытудан кейін, тірі мұздатылған асциттер мен ісік үлгілерінің жалпы санына 10x 5'ген экспрессия хаттамасын қолдана отырып, бір жасушалы транскриптомды секвенирлеу жүргізілді. Бір ісік үлгісінен алынған өміршеңдіктің төмендігі оны қосуға кедергі келтіргенімен, сәйкес келетін ісіктер мен асциттері бар бес жағдай талданды. Пациенттерді бірнеше рет таңдау үшін біз әр пациенттің үлгілерін 10x хром контроллерінің жолақтарына біріктіріп, асциттер мен ісік орындарын бөлек талдадық. Ресеквенирлеуден кейін [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp жұптасқан ұшы (PE), Квебек геномы; Ісік пен асцит үшін жасушаға орташа есеппен 73 488 және 41 378 оқу]], біз CellSNP және Vireo (53) қолдандық (CellSNP негізінде). GRCh38 ұсынған жалпы адам SNP (VCF) донордың сәйкестігіне тағайындалады. Біз науқастың генотип мәртебесінің (IBS) ең жақын сәйкестігін (IBS) анықтау үшін SNPRelate қолданамыз, тағайындалмаған жасушаларды және дуплекс ретінде анықталған жасушаларды және асцит пен ісік үлгілері арасындағы сәйкес донорларды алып тастаймыз (54). Осы тапсырма негізінде біз ісік пен асцитте жасушалардың мол көрінісі бар үш жағдайды талдау үшін сақтап қалдық. Скатер (55) және скран (56) BioConductor қаптамасында массалық сүзу қадамын орындағаннан кейін, талдау үшін 6975 жасуша (ісік пен асциттен сәйкесінше 2792 және 4183 жасуша) алынды. Біз Jaccard қашықтығына негізделген ортақ ең жақын көрші желісінің (SNN) igraph (57) Louvain кластерлеуін қолданамыз. экспрессиясы бойынша кластер жасушалары. Кластерлер маркер генінің экспрессиясына негізделген болжамды жасуша түрлеріне қолмен аннотацияланды және t-SNE арқылы көрнекіленді. Цитотоксикалық Т жасушалары CD8A және GZMA экспрессиясымен анықталады, рибосомалық ақуыз экспрессиясы төмен субкластерлерді қоспағанда. Біз Изар және т.б. жарияланған деректерге (16) қол жеткіздік, оның ішінде олардың t-SNE енуі иммундық жасуша маркерлері мен NNMT экспрессиясы арасындағы экспрессияның қабаттасуын басқара алады.
PBMC лейкоциттерді бөлу өнімдерінен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тығыздығын центрифугалау арқылы бөлінді. CD3 + жасушалары PBMC-ден CD3 моншақтарын (Miltenyi) пайдаланып бөлініп алынды. MNA болған немесе болмаған жағдайда, CD3 + жасушалары пластинамен байланысқан CD3 (5 мкг/мл), еритін CD28 (3 мкг/мл) және IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) арқылы белсендірілді. Кеңейтудің соңғы күнінде тіршілік қабілеті (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) және пролиферациясы (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ағынды цитометрия арқылы бағаланды. Эффекторлық функцияны GolgiStop көмегімен жасушаларды PMA (20 нг/мл) және иономицинмен (1 мкг/мл) 4 сағат бойы ынталандыру арқылы бағалаңыз және CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) және TNFα-флуоресцеин изотиоцианатын (FITC) (MAb11, BD) бақылаңыз. qPCR және ChIP жасушаларын PMA (20 нг/мл) және иономицинмен (1 мкг/мл) 4 сағат бойы ынталандырыңыз. ELISA супернатаны PMA (20 нг/мл) және иономицинмен (1 мкг/мл) ынталандыру алдында және кейін 4 сағат бойы жиналды.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) көмегімен РНҚ-ны бөліп алу үшін өндірушінің хаттамасын орындаңыз. Үлгіні гомогендеу үшін QIAshredder (QIAGEN) пайдаланыңыз. Комплементарлы ДНҚ (cDNA) синтездеу үшін жоғары сыйымдылықты РНҚ-дан кДНҚ-ға дейінгі жинақты (Thermo Fisher Scientific) пайдаланыңыз. Ген экспрессиясын сандық анықтау үшін (өндіруші хаттамасына сәйкес) келесі зондтармен TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) пайдаланыңыз: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [гидрогеннен алынған глицералдегид-3-фосфат (GAPDH)] және Hs01010726_m1 (SLC22A2). Үлгілер MicroAmp оптикалық пленкасы бар MicroAmp жылдам оптикалық 96 ұңғылы реакция пластинасындағы (Applied Biosystems) StepOnePlus нақты уақыт режиміндегі ПТР жүйесінде (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) іске қосылды. 35-тен асатын кез келген Ct мәні анықтау шегінен жоғары болып саналады және анықталмайды деп белгіленеді.
Бұрын сипатталғандай (58) ChIP орындаңыз. Қысқасы, жасушалар формальдегидпен өңделді (соңғы концентрациясы 1,42%) және бөлме температурасында 10 минут инкубацияланды. Қосымша ісіну буферін (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl және 0,1% NP-40) мұзда 10 минут бойы қолданыңыз, содан кейін сипатталғандай (58) иммунопреципитация буферінде қайта суспензиялаңыз. Содан кейін үлгі келесі циклдармен ультрадыбыстық өңдеуден өтті: 10 цикл (20 1 секундтық импульс) және 40 секундтық статикалық уақыт. ChIP дәрежелі иммуноглобулин G (жасуша сигнализациясы технологиясы; 1 мкл), гистон H3 (жасуша сигнализациясы технологиясы; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) және SP1 (жасуша сигнализациясы технологиясы; 3 мкл) антиденелерін үлгіні 4°CC температурада түні бойы шайқап, инкубациялаңыз. А ақуызының түйіршіктерін (Thermo Fisher Scientific) үлгімен 4°C температурада 1 сағат бойы ақырын шайқап инкубациялаңыз, содан кейін ДНҚ-ны байыту үшін хелекс түйіршіктерін (Bio-Rad) пайдаланыңыз және ақуызды қорыту үшін протеиназа K (Thermo Fisher) пайдаланыңыз. ПТР арқылы TNFα промоторы анықталды: алға, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; керісінше, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp өнім). Кескіндер Image Lab (Bio-Rad) арқылы жасалды және ImageJ бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып сандық анықталды.
Жасуша дақылының үстіңгі қабаты жоғарыда сипатталғандай жиналды. Анықтау өндірушінің адамның TNFα ELISA жинағы (Invitrogen), адамның IL-2 ELISA жинағы (Invitrogen) және адамның IFN-γ ELISA жинағы (Abcam) процедураларына сәйкес жүргізілді. Өндірушінің хаттамасына сәйкес, үстіңгі қабат TNFα және IL-2 анықтау үшін 1:100 қатынасында, ал IFN-γ анықтау үшін 1:3 қатынасында сұйылтылды. 450 нм толқын ұзындығындағы сіңірілуді өлшеу үшін EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) пайдаланыңыз.
PBMC лейкоциттерді бөлу өнімдерінен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тығыздығын центрифугалау арқылы бөлінді. CD3 + жасушалары PBMC-ден CD3 моншақтарын (Miltenyi) пайдаланып бөлініп алынды. MNA болған немесе болмаған жағдайда, CD3 + жасушалары пластинамен байланысқан CD3 (5 мкг/мл), еритін CD28 (3 мкг/мл) және IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) арқылы 3 күн бойы белсендірілді. 3 күннен кейін жасушалар жиналып, 0,9% тұзды ерітіндімен жуылды, ал түйіршік мұздатылды. Жасушаларды санау 123count eBeads көмегімен ағынды цитометрия (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) арқылы жүргізілді.
Жоғарыда сипатталғандай метаболиттерді шығарыңыз. Кептірілген сығынды 4000 жасуша эквиваленті/мкл концентрациясында қалпына келтірілді. Үлгіні кері фазалы хроматография (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) және CORTECS T3 бағаны (2.1×150 мм, бөлшектердің өлшемі 1.6-мкм, кеуектердің өлшемі 120-Å; #186008500, Waters) арқылы талдаңыз. Полярлық масс-спектрометр (6470, Agilent), онда электроспрей иондалуы оң режимде жұмыс істейді. Жылжымалы А фазасы 0.1% құмырсқа қышқылынан (H2O-да), жылжымалы В фазасы 90% ацетонитрилден, 0.1% құмырсқа қышқылынан тұрады. LC градиенті 100% A үшін 0-ден 2 минутқа дейін, 99% B үшін 2-ден 7,1 минутқа дейін және 99% B үшін 7,1-ден 8 минутқа дейін. Содан кейін бағанды ​​3 минут бойы 0,6 мл/мин ағын жылдамдығымен жылжымалы A фазасымен қайта теңестіріңіз. Ағын жылдамдығы 0,4 мл/мин, ал бағана камерасы 50°C дейін қыздырылады. Ұстау уақытын (RT) және трансформацияны (RT = 0,882 минут, 1-трансформация = 137→94,1, 2-трансформация = 137→92, 3-трансформация = 137→78) анықтау үшін MNA таза химиялық стандартын (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) пайдаланыңыз. Үш ауысудың барлығы дұрыс сақтау уақытында болған кезде, ерекшелікті қамтамасыз ету үшін сандық бағалау үшін 1-ауыс қолданылады. MNA (Toronto Research Chemical Company) стандартты қисығы 0,1, 1,0, 10 және 100 нг/мл және 1,0 және 10 мкг/мл сұйық стандарттарын алу үшін негізгі ерітіндіні (1 мг/мл) алты реттік сұйылту арқылы жасалды. Анықтау шегі 1 нг/мл, ал сызықтық жауап 10 нг/мл және 10 мкг/мл аралығында. LC/MS талдауы үшін екі микролитрлік үлгі мен стандарттың әрбір инъекциясы қолданылады және талдау платформасының тұрақтылығын қамтамасыз ету үшін әр сегіз инъекция сайын аралас сапаны бақылау үлгісі орындалады. MNA-мен өңделген барлық жасуша үлгілерінің MNA жауаптары талдаудың сызықтық диапазонында болды. Деректерді талдау MassHunter сандық талдау бағдарламалық жасақтамасын (v9.0, Agilent) пайдаланып жүргізілді.
Екінші буын αFR-CAR конструкциясы Song және т.б. (59) материалдарынан алынды. Қысқаша айтқанда, конструкция келесі мазмұнды қамтиды: CD8a жетекші тізбегі, адамның αFR-спецификалық бір тізбекті айнымалы фрагменті, CD8a шарнирі және трансмембраналық аймақ, CD27 жасушаішілік домені және CD3z жасушаішілік домені. Толық CAR тізбегі GenScript арқылы синтезделді, содан кейін трансдукция тиімділігін бағалау үшін пайдаланылған GFP экспрессиялық кассетасының жоғарғы жағындағы екінші буын лентивирустық экспрессия векторына клондалды.
Лентивирус HEK293T жасушаларын трансфекциялау арқылы өндіріледі [Американдық типті дақылдар жинағы (ATCC); 10% ұрық сиырының сарысуы (FBS) және 1% PenStrep бар Дульбекконың модификацияланған Eagle ортасында өсіріледі және CAR-GFP векторы қолданылады. Қаптама плазмидтері (psPAX2 және pMD2.G, Addgene) липофекциялық аминді (Sigma-Aldrich) пайдаланады. Вирус бар супернатант трансфекциядан кейін 48 және 72 сағаттан кейін жиналып, сүзіліп, ультрацентрифугалау арқылы концентрленеді. Концентрленген вирустық супернатант трансдукцияланғанға дейін -80°C температурада сақталады.
PBMC сау донорлық лейкоциттерді бөлу өнімдерінен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиенттік тығыздық центрифугалау арқылы бөлінеді. PBMC-ден CD8+ жасушаларын бөліп алу үшін оң іріктеу CD8 микробұтақтарын (Miltenyi) пайдаланыңыз. Т жасушаларын TransAct (Miltenyi) және TexMACS ортасында ынталандырыңыз [Miltenyi; 3% жылумен инактивтелген адам сарысуымен, 1% PenStrep және IL-2 (300 U/мл) қосылған]. Ынталандырудан кейін жиырма төрт сағаттан кейін Т жасушаларына лентивирус (106 жасушаға 10 мкл концентрацияланған вирус супернатаны) трансдукцияланды. Cytek Aurora-да трансдукциядан кейін 1-3 күннен кейін (FSC (Алға шашыраңқы)/SSC (Бүйірлік шашыраңқы), Singlet, GFP+), жасушалардың GFP экспрессиясын бағалап, трансдукция тиімділігін кемінде 30% көрсетіңіз.
CAR-T жасушалары Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep қосылған) ішінде 24 сағат бойы келесі жағдайларда өсірілді: өңделмеген, 250 мкМ аденозинмен немесе 10 мМ MNA-мен өңделген. Алдын ала өңдеуден кейін CAR-T жасушалары PBS-пен жуылып, 10% FBS және 1% PenStrep қосылған 20 000 SK-OV-3 жасушаларымен [ATCC; McCoy 5A ортасында (Sigma-Aldrich) 10-да біріктірілді: 1 эффектордың нысанаға қатынасы қосылған Immunocult ортасында үш есе көбейтілді. Сандық сапонинмен (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) лизистелген SK-OV-3 жасушалары және SK-OV-3 жасушалары тиісінше теріс және оң бақылау ретінде пайдаланылды. 24 сағаттық бірлесіп өсіруден кейін супернатант жиналып, лактатдегидрогеназа (LDH) өндірушінің нұсқауларына сәйкес өлшенді (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH супернатаны LDH буферінде 1:50 қатынасында сұйылтылды. Өлтіру пайызы келесі формула бойынша өлшенді: өлтіру пайызы = түзету пайызы / максималды өлтіру жылдамдығы x 100%, мұндағы түзету пайызы = тек бірлесіп өсіру - Т жасушалары, ал максималды өлтіру жылдамдығы = оң бақылау - теріс бақылау.
Мәтінде немесе материалдар мен әдістерде сипатталғандай, статистикалық талдау үшін GraphPad Prism 8, Microsoft Excel немесе R v3.6.0 пайдаланыңыз. Егер бір пациенттен бірнеше үлгі жиналса (мысалы, асцит және ісік), біз жұптасқан t-тестті қолданамыз немесе пациентті кездейсоқ әсер ретінде сызықтық немесе жалпыланған модельге қосамыз. Метаболомика талдауы үшін маңыздылық сынағы үш данада орындалады.
Осы мақалаға қосымша материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 сайтынан қараңыз.
Бұл Creative Commons Attribution-Non-Commercial лицензиясының шарттары бойынша таратылатын ашық қолжетімді мақала, ол кез келген құралда пайдалануға, таратуға және көбейтуге мүмкіндік береді, егер соңғы пайдалану коммерциялық пайда табу үшін болмаса және түпнұсқа жұмыс дұрыс болса. Сілтеме.
Ескертпе: Біз сізден тек электрондық пошта мекенжайыңызды беруіңізді сұраймыз, сонда сіз парақшаға ұсынған адам сіздің электрондық поштаны көруін қалайтыныңызды және оның спам емес екенін білуі керек. Біз ешқандай электрондық пошта мекенжайларын тіркемейміз.
Бұл сұрақ сіздің келуші екеніңізді тексеру және спамның автоматты түрде жіберілуін болдырмау үшін қолданылады.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара МакФерсон (Сара МакФерсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Дж. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ралди (Бред Х. Дж. Р. Ф.) ДеБерардинис), Рассел Джонс (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
MNA Т жасушаларының иммундық басуына ықпал етеді және адам қатерлі ісігін емдеу үшін әлеуетті иммунотерапия нысанасын білдіреді.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара МакФерсон (Сара МакФерсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Дж. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ралди (Бред Х. Дж. Р. Ф.) ДеБерардинис), Рассел Джонс (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
MNA Т жасушаларының иммундық басуына ықпал етеді және адам қатерлі ісігін емдеу үшін әлеуетті иммунотерапия нысанасын білдіреді.
©2021 Ғылымды дамыту жөніндегі Америка қауымдастығы. барлық құқықтар қорғалған. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef және COUNTER серіктесі болып табылады. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.