Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Омыртқалылардан айырмашылығы, жәндіктерде еркектерге бағытталған жыныстық стероидты гормондар жетіспейді деп кеңінен айтылады. Anopheles gambiae-де экдизон стероиды 20-гидроксиэкдизон (20E) аналықтар синтездеген кезде жұмыртқаның дамуын бақылау үшін және аталықтар жыныстық жолмен берген кезде жұптасу рефрактерлік кезеңін тудыру үшін эволюцияланған сияқты3. Жұмыртқаның дамуы мен жұптасу репродуктивтік қасиеттер болғандықтан, аналық Anopheles масаларының бұл гормоналды сигналдарды қалай біріктіретінін түсіну безгекті бақылаудың жаңа бағдарламаларын жасауға ықпал етуі мүмкін. Мұнда біз бұл репродуктивті функциялардың экдистероидты белсендіретін/белсенді емес ферменттердің күрделі желісі арқылы әртүрлі жыныстық стероидтармен реттелетінін анықтаймыз. Біз жыныстық жолмен берілістен кейін аналық жыныстық рецептивтілікті тоқтату және дефосфорлану арқылы белсендіру арқылы ата-ананы қорғайтын еркекке тән тотыққан экдизон, 3-дегидро-20E (3D20E) анықтадық. Атап айтқанда, 3D20E берілуі сонымен қатар Plasmodium инфекциясы кезінде жұмыртқаның дамуын қолдайтын репродуктивті гендердің экспрессиясын тудырды, бұл жұқтырған аналықтардың денсаулығын қамтамасыз етеді. Аналықтан алынған 20E... жыныстық реакцияны тудырмайды, бірақ 20E-тежегіш киназалар тежелгеннен кейін жұптасатын даралардың жұмыртқа салуына мүмкіндік береді. Бұл еркекке тән жәндік стероидты гормонының анықталуы және оның әйелдердің жыныстық рецептивтілігін, құнарлылығын және плазмодиймен әрекеттесуін реттеудегі рөлі безгек тарайтын масалардың репродуктивтік табысын төмендету мүмкіндігін көрсетеді.
Адам безгегі паразиттерінің жалғыз тасымалдаушысы болып табылатын Anopheles масаларының инсектицидтерге төзімділігінің кең таралуына байланысты безгек жағдайлары мен өлім-жітім қайтадан артып келеді4. Бұл масалардың жұптасу биологиясы безгекке қарсы күрестің жаңа шаралары үшін ерекше тартымды нысана болып табылады, себебі аналықтары тек бір рет жұптасады5; бұл жалғыз жұптасу оқиғасын стерильді ету даладағы масалар популяциясын азайтуға үлкен мүмкіндік береді.
Әйелдер еркектерден жоғары титрлі стероидты гормондарды қабылдағаннан кейін жыныстық жағынан мүгедек болып қалады. Зерттеулер көрсеткендей, одан әрі жұптасудағы қиындықтардың қоздырғышы 20-гидроксиэкдизон (20E), дернәсіл сатысындағы түю циклінің реттеушісі ретінде белгілі стероидты гормон. Еркектердің 20E синтездеу және тасымалдау қабілеті Африкада таралған және безгектің ең қауіпті векторларын, соның ішінде Anopheles gambiae-ді қамтитын Cellia7 кіші тұқымының құрамына кіретін Anopheles түрлерінде ерекше дамыды. Бұл әсіресе назар аударарлық, себебі бұл түрлерде аналықтар әрбір қаннан кейін 20E өндіреді және 20E оогенез циклін басқарады (8-сілтемені қараңыз). Дегенмен, аналықтардың экдизонның екі түрлі көзінен (еркектердің берілуі және қанмен қоректену индукциясы) сигналдарды өздерінің жұптасу қабілетіне нұқсан келтірмей қалай біріктіретіні туралы аз мәлімет бар. Шын мәнінде, егер аналықтар шығаратын 20E жыныстық төзімсіздікті тудырса, бұл пәк емізетін адамдарда бедеулікке әкеледі, бұл осы масаларда өте кең таралған мінез-құлық5.
Мүмкін болатын түсініктеме - A. gambiae еркектері аналық жыныс жолындағы сигнал беру каскадын белсендіретін, нәтижесінде жұптасу тұрақсыздығына әкелетін модификацияланған еркекке тән экдизонды тасымалдайды. Дегенмен, омыртқалы жануарларда эстроген және андроген сияқты бірнеше стероидты гормондар болғанымен (9-сілтемеде қарастырылған), біздің білуімізше, жәндіктерде андрогенге бейім стероидтар анықталмаған.
Біз жыныстық жетілген A. gambiae еркектік қосалқы безіндегі (MAG) стероидты гормондардың репертуарын анықтауға кірістік, бұл ретте модификациялаушы стероидтарды іздеуге болады. Бұрын қолданылған онша нақты емес әдістің орнына тандемдік масс-спектрометриямен (HPLC-MS/MS) біріктірілген жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясын қолдана отырып, біз бұл тіннен экдизон (E) және 20E анықтадық, бұл алдыңғы нәтижені растады. Дегенмен, үлгіде 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 формуласына сәйкес келетін тотыққан фосфорланған стероидтар басым болды (1-сурет). Басқа формаларға 3-дегидро-20E (3D20E) және 20E-22-фосфат (20E22P) жатады. 3D20E22P-нің HPLC-MS/MS сигналының қарқындылығы оның дефосфорланған түрі 3D20E-ден екі есе жоғары және E және 20E-ден үш есе жоғары болды (1-сурет). Дегенмен, басқа бөліктерінде дене және төменгі репродуктивті жол (LRT; Кеңейтілген деректер 1a-сурет). Біз сондай-ақ жаңадан жабылған (<1 күндік) аталықтар мен аналықтардағы экдистероидтарды талдадық және тек MAG-да 3D20E және 3D20E22P анықтадық; E, 20E және 20E22P екі жыныста да болды (Кеңейтілген деректер 1b-сурет). Бұл деректер A. gambiae ересек аталықтарының аналықтар синтездемейтін MAG-дарында модификациялық гормондардың жоғары титрлерін шығаратынын көрсетеді.
MAG және аналық LRT (жүрекшелерді, шәует көпіршіктерін және пароварийді қоса алғанда) 4 күндік (4 күндік) тың аталықтардан және тың және жұптасқан аналықтардан (0,5, 3 және 12 ат күші/мин) бөлініп алынды. Бұл тіндердегі экдизон HPLC-MS/MS арқылы талданды (орташа ± сем; жұпталмаған t-тест, екі жақты, жалған анықтау жылдамдығы (FDR) түзетілді; NS, маңызды емес; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 сағат vs. 0,5 сағат, P = 0,035; 12 сағат vs. 3 сағат, P = 0,0015; 12 сағат vs. 0,5 сағат, P = 0,030. 3D20E22P: 3 сағат vs. 0,5 сағат, P = 0,25; 12 сағат vs. 3 сағат, P = 0,0032; 12 сағат vs. 0,5 сағат, P = 0,015). Деректер үш биологиялық қайталаудан алынған. Әрбір қызығушылық тудыратын экдизон үшін шың ауданы есептеліп, масалар санымен қалыпқа келтірілді. Экдизон келесідей түспен көрсетілген: E, жасыл; 20E, қызғылт сары; 20E22P, күлгін; 3D20E, көк; 3D20E22P, қызғылт. Кірістірілген сурет экдизон деңгейінің төмендігін көрсету үшін y осі бойынша масштабты арттырады.
3D20E22P және 3D20E жұптасу кезінде берілетінін зерттеу үшін біз жұптасудан кейінгі әртүрлі уақыт кезеңдерінде аналық LRT-лерді бөліп алдық. Экдизон тыңдарда табылмаса да, біз жұптасудан кейін бірден LRT-де 3D20E22P-нің айтарлықтай мөлшерін байқадық (жұптасудан кейін 0,5 сағат, ат/мин), уақыт өте келе төмендеді, ал 3D20E деңгейі айтарлықтай өсті (1-сурет). Химиялық жолмен синтезделген 3D20E-ді стандарт ретінде пайдалана отырып, біз жұптасу LRT-леріндегі осы стероидты гормонның деңгейі 20E-ден кемінде 100 есе жоғары екенін анықтадық (Кеңейтілген деректер кестесі 1). Осылайша, 3D20E22P - жұптасу кезінде аналық LRT-ге берілетін негізгі аталық экдизон, ал оның дефосфорланған түрі, 3D20E, жұптасудан кейін көп ұзамай өте көп мөлшерде болады. Бұл соңғы экдизонның аналық жұптасудан кейінгі биологияда маңызды рөл атқаратынын көрсетеді.
Жаңа РНҚ секвенирлеу (РНҚ-seq) деректер жиынтығын жасағаннан кейін (2a-сурет), арнайы жасалған биоинформатикалық құбырды пайдаланып, біз экдизон киназасын (EcK), экдизон оксидазасын (EO) және 20E-модификацияланған фосфатаза генін кодтайтын экдизонды іздедік. EPP) репродуктивті тіндерде экспрессияланады. Біз бір кандидат EPP генін және екі әлеуетті EcK генін (EcK1 және EcK2) анықтадық, бірақ жақсы кандидат EO генін таба алмадық. Атап айтқанда, жеке EPP гендері Гамбия MAG-ларында жоғары деңгейде (98,9-шы процентиль) экспрессияланды, бірақ әйелдердің LRT-лерінде емес (2b-сурет), бұл біздің күткенімізге қайшы, себебі 3D20E22P депосфорлану осы әйел тінінде орын алды. Сондықтан, біз еркек EPP жұптасу кезінде берілуі мүмкін деп санаймыз. Шынында да, біз жұптасудан кейін аналық ақуызды бүркемелеу үшін in vivo тұрақты изотоптық таңбалауды қолдандық, бұл фермент аналық жүрекшеде MS арқылы анықталды (сурет). 2c және 1-қосымша кесте). MAG және жұптасқан (бірақ таза емес) әйелдердің LRT-де EPP болуы да арнайы антиденелер көмегімен расталды (2d-сурет).
a, Әр жыныстың репродуктивті тіндерінде EcK, EO және EPP кодтайтын гендер іздеуге арналған арнайы жасалған биоинформатикалық құбыр. Көрсеткілердің жанындағы сандар әр қадамдағы еркек және әйел кандидаттарының санын көрсетеді. Бұл талдау еркектерде экспрессияланатын бір EPP генін (EPP) және бір EcK генін (EcK1) және екі жыныста да экспрессияланатын, бірақ кандидат EO генін бермейтін бір EcK генін (EcK2) анықтады.b, Тың (V) және жұптасу (M) Anopheles gambiae және Anopheles albicans тіндеріндегі кандидат ген экспрессиясын салыстыратын жылу картасы. Spca, ұрықтандыру; MAGs, еркектердегі қосымша бездер; дененің басқа бөліктерінде, соның ішінде екі жыныстағы кеудеде, қанаттарда, аяқтарда, майлы денелерде және ішкі мүшелерде, ал әйелдердегі аналық бездерде кездеседі. EcK2 Гамбияның MAG және жүрекшелерінде жоғары деңгейде көрінеді, ал EPP тек MAG.c-де кездеседі, еркек эякулят тобының әйел жүрекшелеріне 3, 12 және 24 ат күшімен транслокациясының протеомикалық талдауы, бұл ең көп таралған 67 ақуызды көрсетеді. Әйелдер барлық ақуыздарды белгілеу (және бүркеу) үшін 15N бар диетада өсірілді. Белгіленбеген еркектер белгіленген аналықтармен жұптастырылды, ал әйел LRT-лер протеомикалық талдау үшін 3, 12 және 24 ат күшімен бөлінді (эякуляциялық ақуыздардың толық тізімін 1-қосымша кестеден қараңыз). Инсет, EPP, Eck1 және EcK2 тың еркектердің MAG-да осы тіндердің протеомикалық талдауы арқылы анықталды.d, EPP жұптастырылған аналықтардың MAG және LRT-де вестерн-блот арқылы анықталды, бірақ тың әйелдерде немесе еркектерде немесе әйелдің қалған бөлігінде анықталмады. дене. Мембраналар бір мезгілде антиактинмен (жүктемені бақылау) және анти-ЭПП антиденелерімен зерттелді. Барлық еркектер тың. Гель көзі туралы деректерді 1-қосымшадан қараңыз. Вестерн-блоттар екі рет жасалды, нәтижелері ұқсас болды.
EPP экдистероидты фосфофосфатаза белсенділігі MAG-дан бөлініп алынған 3D20E22P бар HPLC-MS/MS инкубациясынан кейін тексерілді (Кеңейтілген деректер 2a-сурет). Сонымен қатар, біз EPP-ді РНҚ-арқылы интерференция (RNAi) арқылы тыныштандырған кезде, біз бұл аталықтардың репродуктивті тіндерінде фосфатаза белсенділігінің күрт төмендегенін анықтадық (3a-сурет), ал EPP-мен тыныштандырылған аталықпен жұптасқан аналықтарда гендердің ішінара тыныштандырылуына қарамастан, дефосфорланған 3D20E үлесі айтарлықтай төмен болды (3b-сурет) (Кеңейтілген деректер 2b,c-сурет). Керісінше, біз сол масаларда 20E22P/20E қатынасында айтарлықтай өзгерістерді анықтаған жоқпыз, бұл ферменттің 3D20E22P үшін ерекше екенін көрсетуі мүмкін (3b-сурет).
a, Қос тізбекті EPP РНҚ (dsEPP) немесе қос тізбекті GFP РНҚ (dsGFP) бақылауларын пайдаланып EPP дыбыссыздандырудан туындаған MAG фосфатаза белсенділігінің төмендеуі. Әрбір қайталауда жиырма MAG пулы пайдаланылды (P = 0,0046, жұптасқан t-тесті, екі жақты), бөлек нүктелермен көрсетілген.b, EPP дыбыссыздандырылған аталықтармен жұптасқан аналықтарда 3 ат күші/мин жылдамдықта дефосфорланған 3D20E үлесі айтарлықтай төмен болды (P = 0,0043, жұпталмаған t-тесті, екі жақты), ал 20E деңгейлері өзгерген жоқ (P = 0,063, жұпталмаған). t-тест, екі жақты). Деректер әрқайсысы 13, 16 және 19 аналықтан тұратын үш пулдан алынған орташа ± сем ретінде ұсынылған.c, EPP-үнсіз аталықтармен шағылысқан аналықтардың қайта шағылысу көрсеткіштері айтарлықтай жоғары болды (P = 0,0002, Фишердің дәл сынағы, екі жақты). Аналықтары алдымен шағылысу мәртебесін қамтамасыз ету үшін шағылысуға мәжбүр болды; 2 күннен кейін олар трансгенді сперматозоидтарды тасымалдаушы басқа аталықтармен байланысқа түсіп, трансгенді сандық ПТР анықтау арқылы қайта жұптасу жылдамдығын бағалады.d Қанмен қоректенетін аналықтар ЭПП-мен жұптастырылмаған аталықтармен жұптасқанда құнарлылық айтарлықтай төмендеді (P < 0,0001; Манн-Уитни сынағы, екі жақты) және жұмыртқа саны аздап азайды (P = 0,088, Манн-Уитни сынағы, екі жақты), ал уылдырық шашу жылдамдығына әсер еткен жоқ (P = 0,94, Фишердің дәл сынағы, екі жақты). Барлық панельдерде n биологиялық тәуелсіз маса үлгілерінің санын білдіреді. NS, маңызды емес.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Әрі қарай, біз экдизон дефосфорлануының аналықтарда жұптасу төзімділігін тудыру үшін маңызды екенін бағаладық. Атап айтқанда, ЭПП-мен жұптасқан аналықтар қосымша (трансгендік) аталықтарға ұшыраған кезде бақылау тобындағы аналықтарға (10,4%) қарағанда әлдеқайда жоғары жиілікте (44,9%) қайта жұптастырылды (3c-сурет). Сондай-ақ, біз құнарлылықтың айтарлықтай төмендегенін (3d-сурет, сол жақта) және осы аналықтар салған жұмыртқалар санының аздап азайғанын (3d-сурет, ортада) байқадық, ал аналықтар салған жұмыртқалардың пайызы (аналықтарда жұптасу арқылы туындаған тағы бір жауап)) өзгерген жоқ (3d-сурет, оң жақта). 3D20E22P үшін ЭПП-ның байқалған ерекшелігін ескере отырып, бұл нәтижелер жұптасу кезінде берілетін ЭПП арқылы 3D20E белсенділігі аналықтардың одан әрі жұптасу рецептивтілігін өшіруде маңызды рөл атқаруы мүмкін екенін көрсетеді, бұл мінез-құлық бұрын 20E жыныстық берілуіне байланысты болған. Сондықтан, бұл еркекке тән гормон әйелдердің құнарлылығына да қатты әсер етеді.
Әрі қарай, біз химиялық синтезделген 3D20E (4a–c сурет) және коммерциялық қолжетімді 20E қолданып жыныстық жетілген тыңдарға инъекциялық тәжірибелерде 20E және 3D20E белсенділігін салыстырдық. Біз 3D20E екі концентрацияда да аналықтардың жұптасуға сезімталдығын өшіруде 20E-ге қарағанда айтарлықтай тиімді екенін байқадық (4d сурет). Атап айтқанда, LRT-дегі 3D20E физиологиялық деңгейінің жартысы (инъекциядан кейін 1066 pg және жұптасқаннан кейін 2022 pg) инъекциядан кейін 24 сағаттан кейін, ең жоғары концентрацияда, жұптасқаннан кейін 18 pg кезінде, 20E физиологиялық деңгейінен (инъекциядан кейін 361 pg) 20 есе жоғары рефрактерлік аналықтардың үлесін тудырды; Кеңейтілген деректер кестесі 1). Бұл нәтиже 20E жыныстық жолмен берілуі жұптасу рефрактерлік кезеңдерін тудырмайды деген түсінікке сәйкес келеді және 3D20E ата-ана мен бала арасындағы қарым-қатынасты қамтамасыз етудегі негізгі фактор ретінде көрсетеді. 3D20E тың аналықтардың жұмыртқа салу талдауларында 20E-ге қарағанда айтарлықтай белсенді болды (4e сурет), бұл ішінара EPP үнсіздігінен кейін байқалған қалыпты жұмыртқа салу жылдамдығы жұптасу тудырған аналық факторлармен әлі де пайда болатын қалдық 3D20E белсенділігінің болуына байланысты екенін көрсетеді.
(a,b) 20E-ден химиялық жолмен синтезделген 3D20E (a) өте жоғары конверсия/тиімділікпен (деректер үш тәуелсіз синтез реакциясынан алынған орташа ± sem ретінде ұсынылған) (b).c, Массалық спектр (төменгі жартысы) жұптасқан аналық LRT-де (жоғарғы жартысы).d табылған экдизонға дәл сәйкес келеді, 20E-мен (0,63 мкг, P = 0,02; 0,21 мкг, P < 0,0001; Фишердің дәл сынағы, екі жақты) және 10% этанолмен (0,63 мкг, P < 0,0001; 0,21 мкг, P < 0,0001; Фишердің дәл сынағы, екі жақты) салыстырғанда, ал 20E бақылаудан тек жоғары дозаларда (0,63 мкг, P = 0,0002; 0,21 мкг, P = 0,54; Фишердің дәл сынағы, екі жақты).e, 3D20E инъекциясы 10% этанолды бақылау тобына қарағанда тың аналықтарда уылдырық шашу жылдамдығын айтарлықтай жоғарылатты (0,21 мкг, P < 0,0001; 0,13 мкг, P = 0,0003; Фишердің дәл сынағы, екі жақты), ал бақылау тобымен салыстырғанда 20E жоғары дозаларда ғана (0,21 мкг, P = 0,022; 0,13 мкг, P = 0,0823; Фишердің дәл сынағы, екі жақты). 3D20E жоғары дозаларда 20E-ге қарағанда уылдырық шашу жылдамдығын айтарлықтай жоғарылатты (0,21 мкг, P = 0,0019; 0,13 мкг, P = 0,075; Фишердің дәл сынағы, екі жақты). Барлық панельдерде n биологиялық тәуелсіз маса үлгілерінің санын білдіреді. NS, маңызды емес.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Деректер үш қайталаудан алынған.
Алдыңғы зерттеулерде біз стероидты гормондардың жыныстық жолмен берілуі MISO (жұптасу арқылы индукцияланған оогенез стимуляторы 11) экспрессиясын тудыратынын анықтадық, бұл аналық репродуктивті ген, ол A. gambiae аналықтарын P. falciparum инфекциясынан қорғайды. Адам безгегінің ең қауіпті паразиті 13 тудыратын денсаулық шығындары. MISO-ның безгек эндемиялық аймақтардағы Anopheles репродуктивті денсаулығына маңыздылығын ескере отырып, біз осы геннің экспрессиясын 3D20E немесе 20E гормонының қайсысы іске қосатынын анықтауды шештік. Біз 20E инъекциясы HR3 және HR4 сияқты кейбір ядролық гормон рецепторларын (HR) және Vg14, 15, 16 сияқты типтік төменгі ағыс стероидты нысаналарды арнайы немесе күштірек индукциялағанымен, MISO 3D20E арқылы күштірек индукцияланғанын анықтадық (Кеңейтілген деректер 3-сурет). Осылайша, бұл андрогенді стероидты гормонның жыныстық жолмен берілуі аналықтарды паразиттік инфекциядан туындайтын шығындардан қорғайтын механизмдерді тудыратын сияқты. Сонымен қатар, 3D20E екі изоформаға да әртүрлі әсер етеді. E рецепторы EcR-дің EcR-ді индукциялайтын және EcR-B-ны басатын, сондай-ақ әйелдердің құнарлылығына әсер ететін HPX15 қоса алғанда, басқа жұптасу индукциялайтын гендерді күштірек іске қосатын E рецепторының EcR-дің әсері. Бұл EPP-үнсіз еркектермен жұптасқан әйелдерде байқалатын елеулі бедеулікті түсіндіруі мүмкін (Кеңейтілген деректер 3-сурет). Бұл деректер жынысқа тән функцияның негізінде жатқан екі экдизон гормонымен басымдықпен белсендірілетін төменгі ағыс жолдарының бар екенін көрсетеді.
Әрі қарай, біз биоинформатика құбырымызда анықталған екі EcK генінің функциясын тексердік. EcK1 немесе EcK2-ні өшіру ерлерде айтарлықтай өлімге әкелді (Кеңейтілген деректер 4a-сурет), бұл экдизон фосфорлануының және осылайша инактивацияның өмір сүру үшін маңызды екенін көрсетеді. EcK2 EcK1-ге қарағанда жоғары деңгейде экспрессияланғандықтан және MAG-тарда протеомика арқылы анықталғандықтан (2b,c-сурет және 2-қосымша кесте), біз оның экдистероид киназа белсенділігін 20E-мен инкубациялау арқылы растадық, бұл 20E22P фосфорлануына әкелді (Кеңейтілген деректер 2-сурет).4b). 3D20E-ді субстрат ретінде пайдаланған кезде, біз фосфорланған өнім 3D20E22P-ді анықтай алмадық (Кеңейтілген деректер 4c-сурет), бұл 3D20E орнына 20E EcK2-нің артықшылықты нысанасы болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Біздің РНҚ-секвенциялық талдауымызға сәйкес, EcK2 тың аналықтардың LRT-де де жоғары экспрессияланған, онда ол жұптасқаннан кейін өшірілген (2b-сурет). Біз бұл деректерді растадық және EcK2 экспрессиясына қанмен қоректендіру әсер етпегенін анықтадық (Кеңейтілген деректер 5a-сурет). Бастапқы MS тәжірибелерімізді кеңейте отырып, біз 20E22P шыңының 20E шыңымен тығыз байланысты екенін анықтадық (қанмен қоректенгеннен кейін 22-26 сағат; Кеңейтілген деректер 5b-сурет). Тың аналықтарда EcK2-нің үнсізденуі қанмен қоректенгеннен кейін 26 сағаттан кейін 20E мен 20E22P салыстырмалы қатынасының 3 есеге артуына әкелді (Кеңейтілген деректер 2c және 5c суреттері), бұл EcK2 аналықтарда 20E-ні фосфорлайтынын растайды. Атап айтқанда, EcK2-мен қоректенбеген тыңдар толық жыныстық қабылдауды сақтап қалды (Кеңейтілген деректер 5d,e суреті), бұл аналықтарда 20E өндірісі жұптасуды тудырмайтынын көрсетеді. рефрактерлік кезеңдер. Дегенмен, бұл аналықтардың жұмыртқа салу жылдамдығы бақылау тобымен салыстырғанда айтарлықтай жоғары болды, тыңдардың 30%-дан астамы жұмыртқа салды (Кеңейтілген деректер 5-сурет, f). Егер қос тізбекті Eck2 РНҚ (dsEcK2) инъекциялары қанмен қоректенгеннен кейін жасалса, уылдырық шашу болған жоқ, бұл кезде қан жұтудан туындаған 20E шыңы төмендеді. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер қан сорғаннан кейін пайда болған 20E уылдырық шашуды тудыруы мүмкін деген модельді қолдайды, бірақ тек уылдырық шашу блогы (EcK2 және мүмкін басқа факторлар) жұптасу арқылы өшірілгенде ғана. 20E де, 3D20E инъекциялары да тыңдарда EcK2 экспрессиясын тежеді (Кеңейтілген деректер 5g-сурет, бұл басқа факторлардың бұл киназаның тежелуіне ықпал ететінін көрсетеді. Дегенмен, қанмен қоректенгеннен кейінгі 20E деңгейі жұптасу кезіндегі ыңғайсыздықты тудыру үшін жеткіліксіз болды, бірақ жыныстық жолмен берілетін 3D20E жоғары титрлерімен тиімді түрде іске қосылды.
Біздің нәтижелеріміз A. gambiae көбею табысын реттейтін механизмдер туралы маңызды түсінік береді. Еркектердің 3D20E жоғары титрлерін синтездеу үшін эволюцияланған моделі пайда болды, бұл еркекке тән модификацияланған экдизон, ол аналықтарды одан әрі жұптастыруға сезімталдықты төмендету арқылы ата-ана болуды қамтамасыз етеді. Сонымен қатар, бұл безгек векторлары еркекке тән EPP жыныстық берілуіне жауап ретінде аналықтарда 3D20E белсендірудің тиімді жүйесін де дамытты. Біздің білуімізше, бұл жәндіктерде бірегей және маңызды функцияны орындайтын еркек пен аналық басым стероидты гормон жүйесінің алғашқы мысалы. Еркекке тән экдизон функциясы болжанған, бірақ нақты дәлелденбеген. Мысалы, негізінен жоққа шығарылған гипотеза 18 - бұл функцияларды 20E прекурсоры E1 орындауы мүмкін. Дрозофилада моандрия әйелдің көбею жолын белгілі бір жыныстық пептид рецепторлары арқылы иннервациялайтын нейрондармен әрекеттесетін ұсақ жыныстық пептидтердің19,20 жыныстық берілуімен іске қосылатыны белгілі21,22. Анықтау үшін қосымша жұмыс қажет A. gambiae аналықтарында 3D20E бақылайтын төменгі ағыстағы сигнал беру каскадтары және бұл каскадтардың масалар мен дрозофилалар арасында сақталуы мүмкін бе екенін анықтау.
Біздің зерттеуімізде анықталған 3D20E-нің аналық құнарлылық пен мінез-құлыққа маңызды рөлін ескере отырып, 3D20E синтезі мен белсендіруіне әкелетін жолдар болашақтағы масаларды бақылау стратегиялары үшін жаңа мүмкіндіктер ұсынады, мысалы, стерильді жәндіктер технологиясы стратегияларында бәсекеге қабілетті стерильді аталықтарды генерациялау. Жабайы түрде босату немесе тың ойынында 3D20E-ні имитациялау үшін пайдаланыңыз. 3D20E-нің аталыққа тән функциясы A. gambiae және басқа да Cellia түрлері өз шәуеттерін жұптасу тығындарына коагуляциялау мүмкіндігін алған кезде дамыған болуы мүмкін, себебі бұл көптеген гормондар мен гормондарды белсендіретін ферменттердің тиімді тасымалдануына мүмкіндік береді. Өз кезегінде, монандрияны жүзеге асыратын 3D20E эволюциясы аналықтардың (MISO жоғары экспрессиясы арқылы) безгектің жоғары таралуы бар аймақтарда репродуктивті фитнесін қолдау механизмін ұсынады, бұл жанама түрде плазмодийдің берілуіне ықпал етеді. Аналық 20E-нің аналық Anopheles масаларында P. falciparum-ның тіршілік етуіне және өсуіне терең әсер ететіні көрсетілгенін ескере отырып,24 аталық және аналық стероидты гормон жолдары қазір маса-паразит өзара әрекеттесуінің негізгі аспектілері болып табылады.
A. gambiae G3 штамдары стандартты жәндіктер жағдайында (26-28 °C, 65-80% салыстырмалы ылғалдылық, 12:12 сағат жарық/қараңғы фотопериод) өсірілді. Дернәсілдер ұнтақталған балық жемімен (TetraMin тропикалық үлпектері, Кой түйіршіктері және Тетра тоған таяқшалары 7:7:2 қатынасында) берілді. Ересек масаларға 10% декстроза ерітіндісі және апта сайын адам қаны берілді (қан компоненттерін зерттеу). Тың масалар ұштарын микроскопия арқылы тексергеннен кейін қуыршақ сатысында жыныстарын бөлу арқылы алынды. DsRed трансгенін тасымалдайтын аталықтары бұрын сипатталған.
Мәжбүрлеп жұптастыру тәжірибелері бұрын сипатталған хаттамаларға сәйкес жүргізілді. Табиғи жұптастыру үшін 4 күндік тың аналықтар жыныстық жағынан жетілген тың аталықтармен 1:3 қатынасында екі түн бойы ұсталды. Аталықтарға dsEPP енгізілген тәжірибелер үшін бірлесіп торға отырғызу инъекциядан кейінгі 3-4 күндермен сәйкес келді, бұл кезде фосфатаза белсенділігі максималды түрде басылды (Кеңейтілген деректер 2b-сурет).
Маса тіндері, қалған мәйіттер (дененің қалған бөлігі) немесе тұтас дене 100% метанолға бөлініп, моншақпен (2 мм шыны моншақтар, 2400 айн/мин, 90 сек) гомогенделді. Тіндердің мөлшері мен метанол көлемі келесідей болды: дененің қалған бөлігі, 1000 мкл-де 50; MAG, 50–100 80 мкл; аналық LRT, 25–50 80 мкл. Тұнба метанолдың сол көлемімен екінші метанол экстракциясына ұшырады. Жасуша қалдықтары центрифугалау арқылы жойылды. Екі экстракциядан алынған метанол біріктіріліп, азот ағынымен кептірілді, содан кейін судағы 80% метанолдың келесі көлемінде қайта ерітілді: дененің қалған бөлігі, 50 мкл; MAG және аналық LRT, 30 мкл.
Үлгілер LC құралына (Vanquish, Thermo Fisher) қосылған масс-спектрометрде (ID-X, Thermo Fisher) талданды. 25 °C температурада ұсталатын 3 мкм, 100 × 4,6 мм бағанға (Inspire C8, Dikma) 5 мкл үлгі енгізілді. LC үшін жылжымалы фазалар A (су, 0,1% құмырсқа қышқылы) және B (ацетонитрил, 0,1% құмырсқа қышқылы) болды. LC градиенті келесідей болды: 1 минут бойы 5% B, содан кейін 11 минут ішінде 100% B дейін арттырылды. 100% температурада 8 минуттан кейін бағанды ​​5% B температурада 4 минут бойы қайта теңестіріңіз. Ағын жылдамдығы 0,3 мл мин-1 болды. MS көзіндегі иондау оң және теріс режимдерде қыздырылған электроспрей ионизациясы арқылы жүзеге асырылады.
Масс-спектрометр толық MS режимінде 60 000 ажыратымдылықта 350-ден 680-ге дейінгі m/z диапазонындағы деректерді өлшейді. MS/MS деректері [M + H]+ (барлық нысаналар), [M - H2O + H]+ (барлық нысаналар) және [M - H]- (фосфорланған нысаналар) бойынша алынды. MS/MS деректері стандарты жоқ нысаналардың экдизон қасиеттерін растау үшін пайдаланылды. Мақсатты емес экдистероидтарды анықтау үшін салыстырмалы молдығы >15% болатын барлық HPLC шыңдары үшін MS/MS деректері талданды. Бір нақты үлгінің (барлық басқа нысаналар) абсолютті мөлшерін немесе сұйылтуын есептеу үшін таза стандарттардан (20E, 3D20E) жасалған стандартты қисықтарды пайдаланып сандық анықтау, олардың бір еркекте табылған мөлшерге эквивалентін есептеу. 3D20E үшін сандық анықтау келесі аддукттардың қосындысын пайдаланып жүргізілді: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Деректер Tracefinder (4.1 нұсқасы) көмегімен алынып, сандық анықталды. MS/MS деректері Xcalibur (4.4 нұсқасы) көмегімен талданды. E, 20E және 3D20E MS спектрлері тиісті стандарттармен салыстырылды. 3D20E22P Жирар реактивімен туындылау арқылы талданды. 20E22P m/z қатынасы арқылы талданды.
3D20E22P MAG-тан ​​тазартылды. Тазарту HPLC-MS/MS талдауымен бірдей LC жағдайларында квадрупольді массаға негізделген детекторы (QDa, Acquity, Waters) бар ультра өнімді сұйық хроматографты (Acquity, Waters) пайдаланып аналитикалық шкала бойынша жүргізілді. 3D20E22P-ге сәйкес келетін m/z бұрын анықталғандай сақтау уақытында анықталған кезде фракция жинау іске қосылды. Содан кейін алынған қосылыстардың тазалығы жоғарыда сипатталғандай HPLC-MS/MS арқылы тексерілді.
Жалпы РНҚ 10-12 репродуктивті тіндерден немесе дененің басқа бөліктерінен (бассыз) өндірушінің нұсқауларына сәйкес TRI реагентін (Thermo Fisher) пайдаланып алынды. РНҚ TURBO DNase (Thermo Fisher) арқылы өңделді. кДНҚ өндірушінің нұсқауларына сәйкес Moloney тышқан лейкемия вирусының кері транскриптазасын (M-MLV RT; Thermo Fisher) пайдаланып синтезделді. Кері транскрипцияға арналған сандық ПТР праймерлері (RT-qPCR; Кеңейтілген деректер кестесі 2) бұрын жарияланған24 немесе Primer-BLAST26 көмегімен жасалған, өлшемі 70-150 б.п. және экзон-экзон түйіспелерін қамтитын өнімдерге немесе Primer жұп праймерлеріне бөлек экзондарға артықшылық берілген. Үш-төрт биологиялық қайталаудан алынған кДНҚ үлгілері RT-qPCR үшін суда төрт есе сұйылтылды. Сандық анықтау 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймерлерді және 5 мкл сұйылтылған кДНҚ бар 15 мкл қайталау реакцияларында жүргізілді. Реакциялар ... арқылы жүргізілді. QuantStudio 6 Pro нақты уақыт режиміндегі ПТР жүйесі (Thermo Fisher) және деректері Design and Analysis (2.4.3 нұсқасы) көмегімен жиналып, талданды. Бұл зерттеуде көрсетілгендей, салыстырмалы мөлшер RpL19 рибосомалық геніне (AGAP004422) қалыпқа келтірілді, оның экспрессиясы қанмен қоректену 27 немесе жұптасу 3 кезінде айтарлықтай өзгерген жоқ.
РНҚ сапасы Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) көмегімен тексерілді. Illumina жұптасқан кітапханалары MIT және Гарвардтың Брод институттарында дайындалып, іске қосылды. Реттік оқулар HISAT2 (2.0.5 нұсқасы) көмегімен әдепкі параметрлермен A. gambiae геномына (PEST штаммы, 4.12 нұсқасы) тураланды. Карталау сапасы (MAPQ) ұпайлары <30 болатын оқулар Samtools (1.3.1 нұсқасы) көмегімен жойылды. Гендерге карталанған оқулар саны әдепкі параметрлермен htseq-count (0.9.1 нұсқасы) көмегімен есептелді. Нормаланған оқу саны есептелді және R (4.0.3 нұсқасы) жүйесіндегі DESeq2 пакетін (1.28.1 нұсқасы) пайдаланып дифференциалды ген экспрессиясы талданды.
Экдизонды модификациялайтын ген кандидаттары алдымен A. gambiae геномын PSI-BLAST алгоритмін (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) пайдаланып іздеу арқылы анықталды. Келесі сұрау ақуыз тізбегі бар параметрлердің әдепкі мәндері: Bombyx mori (қосымша нөмірі NP_001038956.1), Musca domestica (қосымша нөмірі XP_005182020.1, XP_005175332.1 және XP_011294434.1) және Microplitis demolitor (қосымша нөмірі XP_008552646.1 және XP_008552645.1) және B. mori (қосымша нөмірі NP_001036900), Drosophila melanogaster (қосымша нөмірі NP_651202) геномынан алынған EcK, Apis mellifera (Қосылу № XP_394838) және Acyrthosiphon pisum (Қосылу № XP_001947166); және B. mori-ден алынған EPP (Қосылу № XP_001947166) NP_001177919.1 және NP_001243996.1) және D. melanogaster EO (Қосылу № NP_572986.1) (1-қадам). Әрі қарай, Гамбиядағы репродуктивті тіндегі (әйелдердің LRT немесе MAG) жоғары мРНҚ экспрессиясына (миллион карталанған оқуға шаққандағы >100 фрагмент/килобазалық экзондар (FPKM) немесе >85%) негізделген сүзгілеу хиттері (2-қадам). Спецификалықты жақсарту үшін біз жұптасу кезінде экдизонды синтездемейтін немесе тасымалдамайтын анофел түрінің A. albimanus репродуктивті тінінде де экспрессияланатын кандидат ферменттерді таңдадық. Кандидат гендер A. albimanus репродуктивті тініндегі төмен экспрессияға (<100 FPKM немесе <85-ші процентиль) негізделіп сүзілді (3-қадам). Соңғы сүзгі ретінде (4-қадам) кандидат гендер келесілердің кем дегенде біреуін қанағаттандыруы керек: (1) дифференциалды экспрессияланған гендерді талдауға сәйкес жұптасудан кейін айтарлықтай жоғарылау (P < 0,05) және (2) репродуктивті емес тіндерде (< 85 % немесе <100 FPKM).
Біз тұтас организмді изотоптық таңбалауға қол жеткізу үшін бұрын сипатталған 28,29,30 әдістерін өзгерттік. Қысқаша айтқанда, жабайы типті Saccharomyces cerevisiae II типті (YSC2, Sigma) азоттың жалғыз көзі ретінде (салмақ/көлем) 2% глюкоза (G7528, Sigma), 1,7% аминқышқылсыз және аммоний сульфаты бар ашытқы азот негізінде (BD Difco, DF0335) және 5% 15N аммоний сульфатында (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) сыналды. Ашытқы центрифугалау арқылы алынды және маса дернәсілдері қуыршақтанғанға дейін еркін берілді. Төртінші жаста өлімнің алдын алу үшін балық ұнымен (300 дернәсілге 0,5 мг) қоспа берілді. Содан кейін жұптасу кезінде берілетін аталық протеомды талдау үшін таңбаланбаған аталықтармен жұптасу тәжірибелерінде тек аналықтар пайдаланылды.
4-6 күндік 15N-белгіленген тың аналықтар жасына сәйкес келетін, белгіленбеген тың аталықтармен жұптасуға мәжбүр болды. Сәтті жұптасу эпифлуоресценциялық микроскопия кезінде жұптасу тығындарын анықтау арқылы расталды. 3, 12 және 24 ат күші/мин жылдамдықпен 45-55 жұптастырылған аналықтардың жүрекшелері 50 мкл аммоний бикарбонаты буферіне (рН 7,8) бөлініп, пестикамен гомогенделді. Гомогенат центрифугаланды және үстіңгі қабат 50 мМ аммоний бикарбонатындағы 50 мкл 0,1% RapiGest (186001860, Уотерс) ерітіндісімен араластырылды. Әрбір үлгіден алынған үстіңгі қабат пен түйіршік құрғақ мұзда мұздатылып, түні бойы Вашингтон университетінің MacCoss зертханасына жөнелтілді, онда LC-MS/MS үшін үлгі дайындау аяқталды. Түйіршікті 50 мкл 0,1% RapiGest ерітіндісінде 50 мкл қайта ерітіңіз. су моншасында бикарбонат және ультрадыбыстық зат. Түйіршік пен үстіңгі қабаттың ақуыз концентрациясы BCA талдауымен өлшенді, үлгілер 5 мМ дитиотреитолмен (DTT; Sigma) азайтылды, 15 мМ йодоацетамидпен (Sigma) алкилденді және 37 °C (1:0 50) температурада 1 сағат бойы трипсинизациямен инкубацияланды: трипсин:субстрат қатынасы). RapiGest 200 мМ HCl қосу арқылы лизистелді, содан кейін қалдықтарды кетіру үшін 37 °C температурада 45 минут инкубацияланды және 4 °C температурада 10 минут бойы 14 000 айн/мин центрифугаланды. Үлгілер қос режимді қатты фазалы экстракциямен (Oasis MCX картридждері, Waters) жуылды және ақуыздың соңғы концентрациясы 0,33 мкг мкл-1 болу үшін 0,1% құмырсқа қышқылында қайта ерітілді. Белгіленбеген MAG протеомдары да таза күйінде талданды. еркектер. Әрбір үлгі үшін екі аналитикалық қайталау талданды. Әрі қарай, әрқайсысынан 1 мкг Jupiter C12 кері фазалы шайырымен (Phenomenex) толтырылған 4 см балқытылған кремний Kasil1 (PQ) фрит тұзағы бар 25 см балқытылған кремний диоксиді 75 мкм бағананы және 180 минуттық сұйық хроматографияны пайдаланып талданды. Үлгі дайджесттері – MS/MS nanoACQUITY UPLC жүйесі (Waters) бар Q-Exactive HF масс-спектрометрінде (Thermo Fisher) іске қосылды. Әрбір іске қосу үшін жасалған деректерге қатысты жинау деректері Proteowizard (3.0.20287 нұсқасы) және Comet31 (3.2 нұсқасы) көмегімен Anopheles gambiae (VectorBase нұсқасы 54), Anopheles coluzzi ақуыз тізбектерін қамтитын FASTA дерекқорына қарсы mzML форматына түрлендірілді. Mali-NIH (VectorBase нұсқасы 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, наурыз 2021), A. gambiae RNA-seq және белгілі адам ластаушы заттарының үш кадрлық аудармаларында іздеу жүргізілді. Пептид картасымен сәйкестендірілген FDR-лер Percolator32 (3.05 нұсқасы) көмегімен 0,01 шегі бар құралды пайдаланып анықталды, ал пептидтер Limelight33 бағдарламасында ақуыз парсимониясын пайдаланып ақуызды идентификациялауға жиналды. (2.2.0 нұсқасы). Салыстырмалы ақуыздың молдығы бұрын сипатталғандай әрбір айналымдағы әрбір ақуыз үшін есептелген қалыпқа келтірілген спектрлік молшылық коэффициентін (NSAF) пайдаланып бағаланды. Әрбір ақуызға қатысты NSAF екі түрлі биологиялық қайталаулардан алынған үлгілер бойынша орташаланды. 15N таңбалау аналық протеомды сәтті жасырды, дегенмен таңбаланған тыңдардан аз мөлшерде таңбаланбаған ақуыз анықталуы мүмкін. Біз аналық шикі үлгілерде тек техникалық айналымдарда аталық ақуыздың азаюын (1-5 спектр) анықтадық, мұнда шикі үлгілер HPLC «алып кетуі» нәтижесінде аталық/жұптасу үлгілерінен кейін жүргізілді. Белгіленген тыңдардан «ластаушы» ретінде табылған кейде ақуыздар 1-қосымша кестеде келтірілген.
Genscript-те екі антигендік пептид, QTTDRVAPAPDQQQ (PA изотипі ішінде) және MESDGTTPSGDSEQ (PA және PB изотипі ішінде). Екі пептид біріктіріліп, KLH тасымалдаушы ақуызымен конъюгацияланып, Жаңа Зеландия қояндарына енгізілді. Қояндар төртінші инъекциядан кейін сойылды, ал жалпы IgG аффинділік тазарту арқылы бөлініп алынды. EPP-спецификалық қоянның IgG-і әрі қарай вестерн-блоттау үшін пайдаланылды.
Батыс блоттары үшін MAG (n = 10, мұндағы n биологиялық тәуелсіз маса үлгілерінің санын білдіреді) және 4 күндік тың аталықтары мен тың немесе күштеп жұптасқан аналықтардан алынған LRT (n = 30) (<10 жұптасқаннан кейін), ақуызды экстракциялау буфері (50 мМ Tris, рН 8.0; 1% NP-40; 0.25% натрий дезоксихолаты; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× протеаза ингибиторының коктейлі (Roche)) бөлек қосылды. Үлгілер диссекциядан кейін бірден моншақпен (2 мм шыны моншақтар, 2400 айн/мин, 90 сек) гомогенделді. Ерімейтін қалдықтар 20 000 г температурада 4 °C температурада центрифугалау арқылы жойылды. Ақуыздар Bradford сынағымен (Bio-Rad) сандық анықталды. Содан кейін 20 мкг MAG ақуызы, 40 мкг LRT ақуызы және 20 мкг Қалдық көлемді ақуыз денатурацияланып, MOPS буферін пайдаланып 10% Bis-Tris NuPAGE арқылы бөлінді. Ақуыздар iBlot2 тасымалдау жүйесін (Thermo Fisher) пайдаланып поливинилиден фторидті мембраналарға ауыстырылды. Мембраналар 1× PBS-T ерітіндісінде екі рет жуылды (PBS ерітіндісінде 0,1% Tween-20), содан кейін Odyssey блоктау буферінде (Li-Cor) 22°C температурада 1 сағат бойы блокталды. Мембраналар 4°C температурада түні бойы арнайы қоян анти-ЭПП поликлоналды бастапқы антиденесімен (блоктау буферінде 1:700) және егеуқұйрық анти-актин моноклоналды бастапқы антиденесі MAC237 (Abeam; 1:4,000) шайқалды. Мембраналар PBS-T ерітіндісімен жуылды, содан кейін 0,01% SDS және 1:20,000 бар блоктау буферінде екінші реттік антиденелермен (есекке қарсы қоян 800CW және ешкіге қарсы егеуқұйрық 680LT (Li-Cor), екеуі де 1:20,000) инкубацияланды. 0,2% Tween -20 ерітіндісін 22 °C температурада 1 сағат бойы ұстаңыз. Мембраналар PBS-T құрылғысымен жуылып, Odyssey CLx сканерімен бейнеленді. Суреттер Image Studio бағдарламасында жиналып, өңделді (5.2 нұсқасы). EPP-RA изоформасына (82 кДа) сәйкес келетін нақты жолақ анықталмады.
EPP кодтау аймақтары (гистидин фосфатаза доменін қамтитын AGAP002463-RB изоформасы ретінде, NCBI сақталған доменді іздеу 34) және EcK2 (AGAP002181) pET-21a(+) плазмидіне (Novagen Millipore Sigma) клондалды; праймерлер Кеңейтілген деректер кестесінің 2-бөлігінде келтірілген. pET-21a(+)-EcK2 конструкциясының C-терминалы 6xHis тегінің алдында сегіз GS4 байланыстырушы (тандемде) енгізілді. Рекомбинантты ақуыздар NEBExpress жасушасыз E. coli ақуыз синтезі реакциясын (New England BioLabs) пайдаланып өндірілді. Рекомбинантты ақуыздар NEBExpress Ni спин колонкаларын (New England BioLabs) пайдаланып тазартылды. Дигидрофолатредуктаза (DHFR) бақылау ақуызы NEBExpress жасушасыз E. coli ақуыз синтезі жинағынан алынған ДНҚ шаблонын пайдаланып өндірілді. Ақуыздар PBS-те 50% глицеринде -20 °C температурада 3 айға дейін сақталды.
ЭПП және тін экстракттарының фосфатаза белсенділігі 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) көмегімен өлшенді. Реакция буферінде 25 мМ Трис, 50 ​​мМ сірке қышқылы, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА және 1 мМ ДТТ болды. Тіндер реакция буферінде гомогенделді, ал жасуша қалдықтары центрифугалау арқылы жойылды. 2,5 мг мл-1 pNPP бар реакция буферіне фермент немесе тін экстрактісі қосу арқылы реакцияны бастаңыз. Реакция қоспасы бөлме температурасында қараңғыда инкубацияланды, ал pNPP-ден түрлендірілген pNP мөлшері әртүрлі уақытта 405 нм-де сіңірілуді өлшеу арқылы сандық түрде анықталды.
In vitro EcK белсенділігі үшін ақуыз 200 мкл буферде (рН 7,5) 0,2 мг 20E немесе 3D20E-мен 10 мМ HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ АТФ және 10 мМ MgCl2 бар 27°C температурада 2 сағат бойы инкубацияланды. Реакция 800 мкл метанол қосу арқылы тоқтатылды, содан кейін -20°C температурада 1 сағат бойы салқындатылды, содан кейін 20 000 г температурада 4°C температурада 10 минут бойы центрифугаланды. Содан кейін супернатант HPLC-MS/MS әдісімен талданды. Бақылау тобында қолданылған ақуыздарды жылумен инактивтеу үшін ақуыздар PBS-те 50% глицеринде 95°C температурада 20 минут бойы инкубацияланды.
In vitro EPP белсенділігі үшін ақуыз 25 мМ Трис, 50 ​​мМ сірке қышқылы, 25 мМ Bis-Tris, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA және 1 мМ DTT бар 100 мкл буферде (рН 7,5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS арқылы тазартылған 18 жұп MAG-та кездесетін мөлшерге баламалы) 27°C температурада 3 сағат бойы инкубацияланды. Реакция 400 мкл метанол қосу арқылы тоқтатылды және -20°C температурада 1 сағат бойы салқындатылды, содан кейін 20 000 г температурада 4°C температурада 10 минут бойы центрифугаланды. Супернатант HPLC-MS/MS арқылы талданды.
EPP (362 б.п.), EcK1 (AGAP004574, 365 б.п.) және EcK2 (556 б.п.) үшін ПТР фрагменттері аралас жынысты бассыз масалардың мәйіттерінен дайындалған кДНҚ-дан күшейтілді. eGFP бақылауының ПТР фрагменті (495 б.п.) бұрын сипатталған pCR2.1-eGFP-ден күшейтілді; ПТР праймерлері Кеңейтілген деректер кестесінің 2-бөлігінде келтірілген. ПТР фрагменті pL4440 плазмидасында төңкерілген T7 промоторларының арасына енгізілді. Плазмидалық конструкциялар NEB 5-α құзыретті E. coli-ден (New England Biolabs) алынды және қолданар алдында ДНҚ секвенирлеу арқылы тексерілді (енгізу реттілігі үшін Қосымша деректер 1 қараңыз). T7 промоторына сәйкес келетін праймерлер (Кеңейтілген деректер кестесі 2) pL4440 негізіндегі плазмидтен енгізілгенді күшейту үшін пайдаланылды. ПТР өнімінің өлшемі агарозды гел электрофорезімен расталды. dsРНҚ ПТР үлгілерінен Megascript T7 транскрипция жинағын (Thermo Fisher) пайдаланып транскрипцияланды және өндірушінің нұсқауларына сәйкес бұрын сипатталған модификациялармен тазартылды.
dsRNA инъекциясы үшін эклозиядан кейін 1 күн ішінде ересек еркектердің немесе әйелдердің (Nanoject III, Drummond) кеуде қуысына 10 нг nl-1 концентрациясында 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) енгізілді. Гендердің нокдаун деңгейі кем дегенде үш биологиялық репликада РНҚ экстракциясы, кДНҚ синтезі және RT-qPCR арқылы анықталды. Экдизон инъекциясы үшін 4 күндік тың немесе 6 күндік тың қанмен қоректенетін әйелдерге тәжірибелік дизайнға байланысты 1,3, 2,1 концентрациясында 0,13, 0,21 немесе 0,63 мкг 20E немесе 3D20E (Nanoject III, Drummond) енгізілді немесе 6,3 нг nl-1 енгізілді. 10% (көлем/көлем) 100 нл енгізіңіз. судағы этанол; 10% этанолдағы 100 нл 3D20E22P (MAG жұбында кездесетін мөлшердің 75%-ына баламалы). Масалар инъекция тобына кездейсоқ түрде бөлінді.
Уылдырық шашу анализі үшін 3 күндік аналықтары адам қанымен тегін тамақтандырылды. Жартылай қоректенген немесе қоректенбеген масаларды алып тастаңыз. Емдеуге байланысты аналықтары қан тамағынан кейін кем дегенде 48 сағат бойы төрт түн бойы бөлек уылдырық шашатын ыдыстарға салынды. Жұмыртқалар стереоскоппен (Stemi 508, Zeiss) саналды; жұптасқан аналықтары үшін дернәсілге айналған жұмыртқалар құнарлы болып саналды.
Жұптасу сынақтары үшін аналықтарға жұптасу төзімділігін дамыту үшін емдеуге байланысты кемінде 2 күн уақыт берілді, ал жабайы типтегі жасы сәйкес келетін аталықтар кейіннен сол торға енгізілді. Екі түннен кейін ұрықтанған аналықтар бөлініп, геномдық ДНҚ мұздату-еріту және ультрадыбыспен 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA және 25 мМ NaCl (рН 8.2) бар буферде шығарылды. Үлгілер протеиназа К (0.86 мкг мкл-1)-мен 55 °C температурада 15 минут, содан кейін 95 °C температурада 10 минут инкубацияланды. Шикі геномдық ДНҚ препараттары 10 есе сұйылтылды және Y хромосома тізбектерін qPCR арқылы анықтауға ұшырады; праймерлер кеңейтілген деректер кестесінің 2-бөлігінде келтірілген. Y хромосома тізбегінің болмауы жұптасу жоқ екенін көрсетеді.
Қайта жұптастыру сынақтары үшін күштеп жұптастырылған аналықтардың жұптасу күйін растау үшін жұптасу тығындарының бар-жоғы тексерілді және бұрын сипатталғандай 36 еркектер болмаған кезде жұптастыруға төзімділіктің дамуына 2 күн уақыт берілді. DsRed трансгенді спермасын тасымалдайтын аталықтары аналық торларға енгізілді. Екі түннен кейін аналықтардан ұрықтандыратын көпіршіктер бөлініп алынды, ал геномдық ДНҚ жоғарыда сипатталғандай дайындалды және DsRed трансгенін qPCR анықтауға ұшырады; праймерлер кеңейтілген деректер кестесінің 2-інде келтірілген. DsRed трансгенінің болмауы қайта жұптасу болмағанын көрсетті.
3D20E бұрын сипатталғандай синтезделді 37. Қысқаша айтқанда, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) 10 мл суда ерітілді, содан кейін 30 мг платина қарасы (ұнтақ түрінде, Sigma-Aldrich) қосылды. Реакция қоспасына O2 ағыны үздіксіз көпіршіктеліп, бөлме температурасында араластырылды. 6 сағаттан кейін реакцияны тоқтату үшін 30 мл метанол қосылды. Катализатор бөлшектерін кетіру үшін қоспа центрифугаланды. Супернатант бөлме температурасында вакуумда құрғақ болғанша буландырылды. Кептірілген реакция өнімі HPLC-MS/MS талдауы үшін инъекцияға арналған 10% этанол мен метанолда ерітілді. Конверсия жылдамдығы (20E-ден 3D20E-ге дейін) шамамен 97% болды (4b-сурет), ал синтезделген 3D20E-нің MS спектрі жұптасқан аналықтарда кездесетін спектрге сәйкес келді (4c-сурет).
Аңызда орындалған статистикалық сынақтардың нақты мәліметтері бар. Фишердің дәл сынағын, Мантель-Кокс сынағын және Студенттің t-тестін орындау үшін GraphPad (9.0 нұсқасы) пайдаланылды. Cochran-Mantel-Haenszel сынақтары арнайы R скриптін пайдаланып орындалды (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test сайтында қолжетімді). Деректердің таралуы 0,05 маңыздылық шегімен Шапиро-Уилк сынағын пайдаланып қалыптылыққа тексерілді. Деректер қалыптылық сынағынан өтпеген кезде, Манн-Уитни сынағы орындалды. Тірі қалу деректері Мантель-Кокс сынағын пайдаланып талданды. DESeq2 пакеті (1.28.1 нұсқасы) РНҚ-секвенция ген деңгейіндегі дифференциалды экспрессия талдауын орындау үшін пайдаланылды. Графиктегі көлденең жолақ медиананы білдіреді. Барлық сынақтар үшін шекті мән ретінде P = 0,05 маңыздылық мәні пайдаланылды.
Зерттеу дизайны туралы қосымша ақпарат алу үшін осы мақалаға сілтеме жасалған Nature Research Report аннотациясын қараңыз.
MS протеомикалық деректері PXD032157 деректер жиынтығы идентификаторымен PRIDE серіктес репозиторийі (https://www.ebi.ac.uk/pride/) арқылы ProteomeXchange консорциумына (http://proteomecentral.proteomexchange.org) сақталды.
РНҚ-секвенция деректер жиынтығы GSE198665 сериялық жазбасы бойынша Gen Expression кешенді кітапханасында (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) сақталады.
Ағымдағы зерттеу барысында жасалған және/немесе талданған қосымша деректер жиынтығын тиісті авторлардан ақылға қонымды сұраныс бойынша алуға болады. Бұл мақалада бастапқы деректер берілген.
Де Луф, А. Экдистероидтар: Жәндіктердің жыныстық стероидтары ескерілмейді ме? Еркек: Қара жәшік. Жәндіктер туралы ғылым.13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон және Anopheles stephens аналық безінің дамуы. Жәндіктер физиологиясы журналы.28, 97–109 (1982).