Секреторлық жолдағы ақуыздарды сұрыптау жасушалардың бөлінуін және гомеостазын сақтау үшін өте маңызды. Қабық арқылы сұрыптаудан басқа, секреторлық тасымалдау процесінде кинезиндерді сұрыптаудағы липидтердің рөлі әлі жауап берілмеген ұзақ уақытқа созылған негізгі сұрақ болып табылады. Мұнда біз өте ұзын керамидті липидті бөліктері бар жаңадан синтезделген гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизацияланған ақуыздардың кластерленгенін және трансмембраналық ақуыздар пайдаланатыннан өзгеше мамандандырылған эндоплазмалық желілік шығу орнына жіктелгенін in vivo дәлелдеу үшін 3D бір мезгілде көп түсті жоғары ажыратымдылықтағы нақты уақыт режимінде бейнелеуді жүргіземіз. Сонымен қатар, біз эндоплазмалық тор мембранасындағы керамидтің тізбек ұзындығының бұл сұрыптау селективтілігі үшін маңызды екенін көрсетеміз. Біздің зерттеуіміз ақуыз жүктерін липидті тізбек ұзындығына негізделген селективті экспорт орындарына жіктеудің алғашқы тікелей in vivo дәлелін ұсынады.
Эукариоттық жасушаларда эндоплазмалық торда (ЭТ) синтезделген ақуыздар секреторлық жол арқылы тасымалдау кезінде тиісті жасушалық тағайындалған жерге жеткізу үшін сұрыпталады (1). Қабық арқылы сұрыптаудан басқа, белгілі бір липидтер белгілі бір ақуыздармен байланысты белгілі бір мембраналық домендерге кластерлеу арқылы селективті шығу нүктелері ретінде де қызмет ете алады деген болжам ұзақ уақыт бойы айтылып келді (2-5). Дегенмен, бұл мүмкін липидке негізделген механизмді дәлелдейтін тікелей in vivo дәлелдер әлі де жетіспейді. Бұл негізгі мәселені шешу үшін біз ашытқыда гликозилфосфатидилинозитол (ГПИ) бекітілген ақуыздарының (ГПИ-АП) ЭТ-дан қалай дифференциалды түрде экспортталатынын зерттедік. ГПИ-АП - липидтермен байланысқан жасуша бетінің ақуыздарының бір түрі (6, 7). ГПИ-АП - плазмалық мембрананың сыртқы жапырақшаларына гликолипид бөлігі (ГПИ бекіткіші) арқылы бекітілген бөлінетін ақуыз. Олар ГПИ бекіткіштерін ЭТ люменіндегі консервативті посттрансляциялық модификациялар ретінде қабылдайды (8). Бекітілгеннен кейін, GPI-AP Гольджи аппараты (5, 9) арқылы ЭР-дан плазмалық мембранаға өтеді. GPI якорьлерінің болуы GPI-AP-тың трансмембраналық бөлінетін ақуыздардан (басқа плазмалық мембраналық ақуыздарды қоса алғанда) секреторлық жол бойымен бөлек тасымалдануына әкеледі (5, 9, 10). Ашытқы жасушаларында GPI-AP эндоплазмалық тордағы басқа бөлінетін ақуыздардан бөлінеді, содан кейін II қабатты ақуыз кешенімен (COPII) оралған бірегей көпіршіктерге оралады (6, 7). ЭР экспорттау процесіндегі бұл жіктеу процесінің детерминанттары түсініксіз, бірақ бұл механизм липидтерді, әсіресе GPI якорінің липидтік бөлігінің құрылымдық қайта құрылуын қажет етуі мүмкін деген болжам бар (5, 8). Ашытқыда GPI липидтік қайта құрылуы GPI бекітілгеннен кейін бірден басталады және көптеген жағдайларда керамидтің 26-көміртекті ұзын тізбекті қаныққан май қышқылына (C26:0) байланысуына себеп болады (11, 12). C26 церамиді ашытқы жасушалары әлі күнге дейін өндіретін негізгі керамид болып табылады. Ол ER-де синтезделеді және оның көп бөлігі COPII көпіршіктері арқылы Гольджи аппаратына экспортталады (13). GPI-AP ER экспорты үшін үздіксіз керамид синтезі қажет (14, 15), ал өз кезегінде Гольджи аппаратында керамидтің инозитолфосфат церамидіне (IPC) айналуы GPI якорь синтезіне байланысты (16). Жасанды мембраналармен жүргізілген биофизикалық зерттеулер өте ұзын ацил тізбекті керамидтердің бірегей физикалық қасиеттері бар реттелген домендерді қалыптастыру үшін бірігуі мүмкін екенін көрсетті (17, 18). Бұл деректер C26 церамиді мен GPI-AP C26 церамидімен бірге өздерінің физикалық қасиеттерін салыстырмалы түрде ретсіз ER мембраналық липидтік ортада реттелген аймақтарға немесе аймақтарға бірігу үшін пайдаланады деген болжамға әкеледі. Ол негізінен қысқа және қанықпаған глицеролипидтерден тұрады (C16:1 және C18:1) (19, 20). Бұл аймақтар церамид пен керамид негізіндегі GPI-AP бірдей арнайы COPII көпіршігінде (5) Гольджиге бірге тасымалдануы мүмкін нақты ER шығу орындарына (ERES) таңдамалы түрде шоғырланады.
Бұл зерттеуде біз флуоресцентті түрде белгіленген ақуыздарды бір мезгілде бақылай алатын заманауи микроскопия әдісі болып табылатын аса ажыратымдылықтағы конфокальды нақты уақыттағы бейнелеу микроскопиясын (SCLIM) қолдану арқылы осы липидке негізделген механизмді тікелей сынап көрдік. Үш түсті және үш өлшемді (3D) кескіндер тірі жасушаларда өте жоғары ажыратымдылыққа және жылдамдыққа ие (21, 22).
Біз алдымен SCLIM технологиясын қолданып, S. cerevisiae-де ER-ден шыққаннан кейін трансмембраналық бөлінетін ақуыздардан C26 керамид тобы бар қалыпты GPI-AP қалай скринингтен өткенін анықтадық. ER жіктелуін тексеру үшін біз in vivo ERES-ке кіретін жаңа синтезделген жүкті тікелей көре алатын генетикалық жүйені қолдандық (7, 23). Жүк ретінде біз жасыл флуоресцентті ақуызбен (GFP) белгіленген C26 керамид негізіндегі GPI-AP Gas1 және жақын инфрақызыл флуоресцентті ақуызбен (iRFP) белгіленген трансмембраналық бөлінетін Mid2 ақуызын таңдадық, екеуі де плазмалық мембранаға бағытталған (24–26). sec31-1 температураға сезімтал мутантында бұл екі жүк галактоза индукцияланатын промотор және конститутивті ERES маркері астында экспрессияланады. Төтенше температурада (37°C), sec31-1 мутациясы COPII қабық компоненті Sec31-дің COPII өнуін және ER экспортын тежеу ​​​​функциясына әсер ететіндіктен, жаңадан синтезделген жүк ER-де жиналады (23). Төмен температураға (24°C) дейін салқындағаннан кейін, sec31-1 мутант жасушалары секреторлық аймақтан қалпына келді, ал жинақталған жаңа синтетикалық жүк жедел жәрдем бөлімінен экспорттала бастады. CLIM визуализациясы жаңадан синтезделген Gas1-GFP және Mid2-iRFP көпшілігі 37°C температурада инкубациядан кейін де sec31-1 мутант жасушаларының жедел жәрдем бөлімінде жиналып, содан кейін 24°C температурада 5 минут бойы босатылғанын көрсетті (1-сурет). Mid2-iRFP бүкіл жедел жәрдем бөлімінің мембранасында таралғандықтан, ал Gas1-GFP үздіксіз жедел жәрдем бөлімінің мембрана аймағында шоғырланған және жиналғандықтан, олардың таралуы мүлдем басқаша (1-сурет, A-дан C-ға дейін және Movie S1). Сонымен қатар, 1D суретте көрсетілгендей, Gas1-GFP кластерінде Mid2-iRFP жоқ. Бұл нәтижелер GPI-AP және трансмембраналық ақуыздардың ертерек әртүрлі жедел жәрдем бөлімінің мембрана аймақтарына бөлінгенін көрсетеді. Gas1-GFP кластері mCherry компаниясының COPII қабық ақуызы Sec13 (1-сурет, E және F, және S1 фильмі) деп белгіленген белгілі бір ERES-ке жақын орналасқан (23).
sec31-1 жасушалары галактоза тудыратын секрецияларды экспрессиялайды, ұзын ацил тізбегі (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, жасыл) және трансмембраналық ақуыз Mid2-iRFP (TMP, көк) және осы конструктивті ERES таңбалауы Sec13-mCherry (ERES, қызыл күрең) 37°C температурада 30 минут инкубацияланды, 24°C-қа жылжытылды және 5 минуттан кейін SCLIM арқылы бейнеленді. (A-дан C-ға дейін) жазықтықтың біріктірілген немесе жалғыз 2D кескінін (A), 10 z-қиманың 2D проекциялық кескінін (B) немесе жүктің және ERES маркерлерінің 3D жасуша жарты шарының кескінін (C) көрсетеді. Масштаб жолағы 1 мкм (A және B). Масштаб бірлігі 0,551 мкм (C). Gas1-GFP дискретті ER аймақтарында немесе кластерлерінде анықталды, ал Mid2-iRFP анықталды және ER мембранасы бойынша таратылды (C). (D) График Gas1-GFP кластеріндегі Gas1-GFP және Mid2-iRFP салыстырмалы флуоресценция қарқындылығын ақ көрсеткі сызығы (сол жақта) бойымен көрсетеді. AU, кездейсоқ бірлік. (E және F) тауарлар мен ERES белгісін біріктіретін 3D кескінді білдіреді. Gas1-GFP кластерлері нақты ERES маңында анықталды. Масштаб бірлігі 0,551 мкм. (F) Ақ тұтас көрсеткі ERES-пен байланысты Gas1-GFP кластерін белгілейді. Ортаңғы және оң жақ панельдер біріктірілген үлкейтілген 3D кескінін және таңдалған Gas1-GFP кластерінің айналмалы көрінісін көрсетеді.
Gas1-GFP кластері мен нақты ERES арасындағы тығыз кеңістіктік байланыс Gas1-GFP селективті ERES-ке кіре алатынын көрсетеді, бұл Mid2-iRFP ER-ден шығу үшін пайдаланатын селективтіліктен өзгеше. Бұл мүмкіндікті шешу үшін біз тек бір немесе екі тауар үшін ERES қатынасын сандық түрде анықтадық (2-сурет, A-дан C-ға дейін). Біз ERES-тің көпшілігінде (70%) тек бір ғана жүк түрі бар екенін анықтадық. 2C суретінің төменгі суретінде тек Gas1-GFP (1-сурет) немесе тек Mid2-iRFP (2-сурет) бар ERES-тің екі типтік мысалы көрсетілген. Керісінше, ERES-тің шамамен 20%-ында бір аймақта қабаттасатын екі жүк бар. Кейбір ERES-те (10%) екі түрлі жүк бар екені анықталды, бірақ олар айқын әртүрлі аймақтарда оқшауланған. Сондықтан, бұл статистикалық талдау ER экспортталғаннан кейін GPI-AP Gas1-GFP және трансмембраналық жүк Mid2-iRFP әртүрлі ERES-ке бөлінетінін көрсетеді (2D сурет). Бұл сұрыптау тиімділігі алдыңғы биохимиялық талдаумен (6) және морфологиялық анықтаумен (7) өте сәйкес келеді. Біз сондай-ақ карантинге жатқызылған жүктің ERES-ке түсуін бақылай аламыз (2E сурет және S2 фильмі). 2E суретінде Gas1-GFP (3-панель) немесе Mid2-iRFP (4-панель) аз ғана бөлігі ERES-ке бір жағынан кіретіні және бөлек аймақта шектелгені көрсетілген. 2E суретінің 5-панелінде Gas1-GFP және Mid2-iRFP кейде бір ERES-те кездесетіні, бірақ олар әртүрлі жақтан кіретіні және әртүрлі COPII көпіршіктерін білдіруі мүмкін бөлек аймақтарда шоғырланғаны көрсетілген. Біз сондай-ақ C26 керамид негізіндегі GPI-AP Gas1-ді селективті ERES ретінде бөлу және жіктеу ерекше екенін растадық, себебі басқа трансмембраналық секреция жүктемесі, GFP-белгіленген плазмалық мембраналық ақуыз Axl2 (27), Mid2-iRFP-ке ұқсас мінез-құлық көрсетеді. (S1 суреті және S3 фильмі). Жаңадан синтезделген Axl2-GFP ER мембранасы арқылы Mid2-iRFP сияқты таралады (S1, A және B суреттері) және көптеген ERES-те Mid2-iRFP-мен бірге орналасады (S1, B-D суреттері). 1-суреттің 1 және 2 панельдері. S1C екі трансмембраналық жүктің қабаттасатын ERES-тің екі типтік мысалын көрсетеді. Бұл жағдайларда екі тауар да ERES-ке бірге енеді (S1E суреті, 3-панель және S3 фильмі).
Галактоза индукцияланатын секрецияларды экспрессиялайтын sec31-1 жасушалары, Gas1-GFP (GPI-AP, жасыл) және Mid2-iRFP (TMP, көк) және Sec13-mCherry (ERES, қызыл күрең) конститутивті ERES белгілеуі 37°C температураға орналастырылды. °C температурада 30 минут инкубациялағаннан кейін, секреция блогын босату үшін 24°C температураға жылжытыңыз және 20 минуттан кейін SCLIM көмегімен суретке түсіріңіз. (A-дан C-ға дейін) Жүктің және ERES-пен белгіленген 10 z-қиманың репрезентативті 2D проекциялық кескіндері (A; масштаб жолағы, 1μm) немесе 3D жасуша жарты шарларының кескіндері (B және C; масштаб бірлігі, 0,456μm). (B) ішіндегі төменгі панель және (C) ішіндегі панель өңделген кескіндерді тек ERES-те бар тауарларды (қызыл күрең) көрсету үшін көрсетеді [Gas1-GFP (сұр) және Mid2-iRFP (ашық көк)]. (C) Ашық көрсеткі: ERES тек бір жүк бөлігін тасымалдайды (1-ден 4-ке дейін). Сұр көрсеткі: ERES бөлек жүкті қамтиды (5). Ақ тұтас көрсеткі: бірге орналасқан жүкті қамтитын ERES. Төменде: Таңдалған жалғыз ERES құрамында тек Gas1-GFP (1) немесе Mid2-iRFP (2) бар. Масштаб жолағы, 100 нм. (D) (C) бөлімінде сипатталған фотомикрографтың сандық бағалауы. Тек бір жүкті (Gas1-GFP немесе Mid2-iRFP), бөлек жүкті және қабаттасатын жүкті қамтитын ERES орташа пайызы. Үш тәуелсіз экспериментте 54 ұяшықта n=432. Қате жолағы = SD. Екі жақты жұпталмаған t сынағы. *** P = 0.0002. (E) (C) белгісімен белгіленген карантинге қойылған жүктің таңдалған ERES 3D кескіні. Gas1-GFP (жасыл) (3) немесе Mid2-iRFP (көк) (4) бір жағынан ERES (қызыл күрең) ішіне кіреді және ERES ішіндегі шағын аймақпен шектеледі. Кейде екі жүк түрі де бір жағынан бір ЭРЕС-ке (5) кіреді және ЭРЕС ішіндегі оқшауланған аймақпен шектеледі. Масштаб жолағы, 100 нм.
Әрі қарай, біз ER мембранасында болатын ұзын ацил тізбекті керамидтің (C26) Gas1-дің селективті ERES-ке нақты кластерленуін және сұрыпталуын басқарады деген гипотезаны тексердік. Осы мақсатта біз модификацияланған ашытқы штаммы GhLag1 қолдандық, онда екі эндогенді керамид синтазасы Lag1 және Lac1 GhLag1-мен (мақтаның Lag1 гомологы) ауыстырылды, нәтижесінде жасуша мембранасы жабайы типтен қысқа керамид штаммы бар ашытқы штаммы пайда болды (3A сурет) (28). Масс-спектрометрия (MS) талдауы жабайы типті штамдарда жалпы керамидтің 95%-ы өте ұзын (C26) тізбекті керамид екенін, ал GhLag1-де керамидтің 85%-ы өте ұзын (C18 және C16) екенін көрсетті. ), керамидтің тек 2%-ы өте ұзын (C26) тізбекті керамид болып табылады. C18 және C16 керамидтері әзірге GhLag1 мембранасында анықталған негізгі керамидтер болғанымен, MS талдауы сонымен қатар GhLag1 штаммында экспрессияланған Gas1-GFP GPI якорінің құрамында жабайы типті липидтермен салыстыруға болатын C26 керамидінің бар екенін растады. Сапасы бірдей (3A сурет) (26). Демек, бұл Cwh43 керамидті қайта құру ферменті C26 керамидіне жоғары селективті екенін білдіреді, 26-суретте көрсетілгендей, ол GhLag1 штаммындағы аз мөлшердегі C26 керамидінен GPI якорін артықшылықпен біріктіреді. S2 (29). Соған қарамастан, GhLag1 жасуша мембранасында негізінен тек C18-C16 керамид бар, ал Gas1-GFP-де әлі де C26 керамид бар. Бұл факт бұл штаммды ER-дегі мембраналық керамидтің ацил тізбегінің ұзындығы мәселесін арнайы шешу үшін тамаша құрал етеді. Класс пен сұрыптаудың гипотетикалық рөлі. Содан кейін біз алдымен C26 Gas1-GFP-нің GhLag1-де sec31-1 температураға сезімтал мутантты аллелі бар кластерлерде жиналу қабілетін дәстүрлі флуоресценциялық микроскопия арқылы зерттедік, мұнда тек ұзын (C18-C16) тізбек ER мембранасындағы Ceramide-те болады (3-сурет). Біз 31-1-1-де Gas1-GFP-нің көп бөлігі кластерлерде шоғырланғанын, ал ұзын (C18-C16) ұзын керамидті ER мембранасы бар 31-1-1 GhLag1-дегі Gas1-GFP негізінен кластерленбегенін және бүкіл ER мембранасында таралмағанын байқадық. Дәлірек айтқанда, C26 керамидіне негізделген кластерлеу нақты ERES-пен тығыз байланысты болғандықтан (1-сурет), біз бұл процестің ER экспорттық ақуыз механизмінің функциясын қамтуы мүмкін бе, жоқ па, соны зерттедік. GPI-AP ER экспорты үшін арнайы COPII жүйесін пайдаланады, ол GPI якорінің гликан бөлігін Ted1 құрылымдық қайта құруымен белсенді түрде реттеледі (30, 31). Рекомбинантты GPI-гликан трансмембраналық жүк рецепторы p24 кешенімен танылады, ол өз кезегінде COPII жүк байланыстырушы негізгі суббірлігі Sec24-тің ерекше изоформасы болып табылатын Lst1-ді таңдамалы түрде тартып, GPI-AP-ға бай COPII көпіршіктерін түзеді (31-33). Сондықтан біз осы жеке ақуыздардың (p24 кешенінің компоненті Emp24, GPI-гликанды қайта құру ферменті Ted1 және COPII арнайы суббірлігі Lst1) sec31-1 мутантты штаммымен делециясын біріктіретін қос мутант құрдық және оларды зерттедік. Gas1-кластерлік GFP түзу мүмкін бе (3-сурет). Біз sec31-1emp24Δ және sec31-1ted1Δ кезеңдерінде Gas1-GFP негізінен кластерленбеген және ER мембранасы бойынша таралғанын байқадық, бұл бұрын sec31-1 GhLag1 кезеңдерінде байқалғандай, ал sec31-1lst1Δ кезеңде Gas1-GFP sec31-1 сияқты. Бұл нәтижелер ER мембранасында C26 керамидінің болуымен қатар, Gas1-GFP кластерленуі де p24 кешенімен байланысуы керек екенін және арнайы Lst1 тартуды қажет етпейтінін көрсетеді. Содан кейін біз ER мембранасындағы керамидтің тізбек ұзындығы Gas1-GFP-нің p24-пен байланысуын реттей алатындығын зерттедік. Дегенмен, мембранада C18-C16 керамидінің болуы p24 кешенімен қалпына келтірілген GPI-гликандарға (S3 және S4, A және B суреттері) немесе GPI-AP-пен байланысуға және GPI-AP экспорттауға әсер етпейтінін анықтадық. COPII Lst1 кіші түрін алыңыз (S4C сурет). Сондықтан, C26 керамидке тәуелді кластерлеу ақуыздың әртүрлі ER экспорттық ақуыз механизмдерімен өзара әрекеттесуін қажет етпейді, бірақ липид ұзындығымен басқарылатын балама сұрыптау механизмін қолдайды. Содан кейін, біз ER мембранасындағы керамид ацил тізбегінің ұзындығы Gas1-GFP селективті ERES ретінде тиімді жіктеу үшін маңызды ма екенін талдадық. Қысқа тізбекті керамидпен GhLag1 штаммындағы Gas1 ER-ден шығып, плазмалық мембранаға енетіндіктен (S5 сурет), егер сұрыптау керамид ацил тізбегінің ұзындығымен басқарылса, GhLag1 штаммындағы Gas1 қайта бағытталуы және қиылысуы мүмкін деп санаймыз. Сол мембранасы бар ERES тауарлары.
(A) GhLag1 жасуша мембранасында негізінен қысқа C18-C16 керамидтері бар, ал Gas1-GFP GPI якорінде жабайы типті жасушалар сияқты C26 IPC бар. Жоғарыда: жабайы типті (Wt) және GhLag1p штамдарының жасуша мембранасындағы керамидтің ацил тізбегінің ұзындығын масс-спектрометрия (MS) арқылы талдау. Деректер жалпы керамидтің пайызын көрсетеді. Үш тәуелсіз эксперименттің орташа мәні. Қателік жолағы = SD. Екі жақты жұпталмаған t-тест. **** P <0.0001. Төменгі панель: жабайы типті және GhLag1p штамдарында көрсетілген Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI якорінде бар IPC ацил тізбегінің ұзындығын MS талдауы. Деректер жалпы IPC сигналының пайызын көрсетеді. Бес тәуелсіз эксперименттің орташа мәні. Қателік жолағы = SD. Екі жақты жұпталмаған t-тест. ns, маңызды емес. P = 0.9134. (B) Галактозамен индукцияланған Gas1-GFP экспрессиялайтын sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ және sec31-1lst1Δ жасушаларының флуоресценциялық микрографиялары 37°C температурада 30 минут инкубацияланды және 24°C-тан кейін әдеттегі флуоресценциялық микроскопияны орындау үшін төмендетілді. Ақ көрсеткі: ER Gas1-GFP кластері. Ашық көрсеткі: Кластерленбеген Gas1-GFP бүкіл ER мембранасында таралған, бұл ER-ге тән ядролық сақинаның бояуын көрсетеді. Масштаб жолағы, 5 мкм. (C) (B) бөлімінде сипатталған фотомикрографияның сандық бағалауы. Gas1-GFP нүктелік құрылымы бар жасушалардың орташа пайызы. Үш тәуелсіз экспериментте n≥300 жасуша. Қате жолағы = SD. Екі жақты жұпталмаған t-тест. **** P <0.0001.
Бұл мәселені тікелей шешу үшін біз sec31-1 температураға сезімтал мутантты аллелмен GhLag1-дегі Gas1-GFP және Mid2-iRFP SCLIM визуализациясын жүргіздік (4-сурет және S4 фильмі). ER 37°C температурада сақталғаннан кейін және кейіннен 24°C температурада шығарылғаннан кейін, жаңадан синтезделген Gas1-GFP көп бөлігі кластерленбеген және ER мембранасы бойынша таралмаған, бұл дәстүрлі микроскоптармен байқалған (4-сурет, A және B). Сонымен қатар, ERES-тің үлкен пайызы (67%) онда бірге орналасқан екі түрлі жүкті қамтиды (4D сурет). 4C суретінің 1 және 2 панельдерінде Gas1-GFP және Mid2-GFP қабаттасатын ERES-тің екі типтік мысалы көрсетілген. Сонымен қатар, екі тауар да бір ERES-ке тартылды (4E суреті, 3-панель және S4 фильмі). Сондықтан, біздің нәтижелеріміз ER мембранасындағы керамид ацил тізбегінің ұзындығы ER ақуыздарының агрегациясы мен жіктелуінің маңызды детерминанты екенін көрсетеді.
Sec31-1 Галактоза тудыратын секрецияларды экспрессиялайтын GhLag1 жасушалары, Gas1-GFP (GPI-AP, жасыл) және Mid2-iRFP (TMP, көк) және ERES-белгіленген Sec13-mCherry (ERES, қызыл күрең). 37°C температурада инкубациялаңыз. 30 минут бойы жалғастырыңыз, секрецияларды шығару үшін 24°C-қа дейін төмендетіңіз және 20 минуттан кейін SCLIM көмегімен суретке түсіріңіз. (A-дан C-ға дейін) Жүк және ERES-пен белгіленген 10 z-қиманың репрезентативті 2D проекциялық кескіндері (A; масштаб жолағы, 1μm) немесе 3D жасуша жарты шарларының кескіндері (B және C; масштаб бірлігі, 0,45μm). (B) ішіндегі төменгі панель және (C) ішіндегі панель өңделген кескіндерді тек ERES-те бар тауарларды (қызыл күрең) көрсету үшін көрсетеді [Gas1-GFP (сұр) және Mid2-iRFP (ашық көк)]. (C) Ақ толтырылған көрсеткі: ERES, тауарлар қабаттасады. Ашық көрсеткі: ERES құрамында тек бір элемент бар. Төменгі панель: Таңдалған ERES құрамында (C) белгіленген қабаттасатын тауарлар (1 және 2) бар. Масштаб жолағы, 100 нм. (D) (C) сипатталған фотомикрографтың сандық бағалауы. 31-1 және 31-1 сек GhLag1 бірліктерінде тек бір жүк (Gas1-GFP немесе Mid2-iRFP) және оқшауланған жүк пен қабаттасатын жүк үшін ERES орташа пайызы қосылған. Үш тәуелсіз экспериментте 54 ұяшықта n = 432 (31-1 сек) және 47 ұяшықта n = 430 (31-1 сек GhLag1). Қате жолағы = SD. Екі жақты жұпталмаған t сынағы. *** P = 0.0002 (31-1 сек) және ** P = 0.0031 (31-1 сек GhLag1). (E) (C) белгіленген қабаттасатын жүк (3) бар таңдалған ERES-тің 3D кескіні. Gas1-GFP (жасыл) және Mid2-iRFP (көк) ERES-ке (қызыл күрең) бір жағынан жақындайды және сол ERES шектеулі аймағында қалады. Масштаб жолағы, 100 нм.
Бұл зерттеу липид негізіндегі ақуыз жүктерінің секреторлық жолда селективті экспорттық орындарға жіктелетіні туралы тікелей in vivo дәлелдерін ұсынады және жіктеу селективтілігі үшін ацил тізбегінің ұзындығының маңыздылығын ашады. SCLIM деп аталатын қуатты және заманауи микроскопия әдісін қолдана отырып, біз ашытқыдағы жаңадан синтезделген Gas1-GFP (өте ұзын ацил тізбегі (C26) керамид липидтік бөлігі бар негізгі плазмалық мембрана GPI-AP) көрсеттік. Дискретті ЭР-ларда топтастырылған аймақтар нақты ЭРЭС-пен байланысты, ал трансмембраналық бөлінетін ақуыздар ЭР мембранасы бойынша таралады (1-сурет). Сонымен қатар, бұл екі түрлі тауарлар әртүрлі ЭРЭС-ке селективті түрде енеді (2-сурет). Мембранадағы жасушалық керамидтің ацил тізбегінің ұзындығы C26-дан C18-C16-ға дейін азаяды, Gas1-GFP кластері дискретті ЭР аймағына бұзылады және Gas1-GFP сол ЭРЭС арқылы трансмембраналық ақуызбен ЭР-дан кету үшін қайта бағытталады (3-сурет және 3-сурет). 4).
GPI-AP ER-ден шығу үшін мамандандырылған ақуыз механизмін қолданғанымен, біз C26 керамидіне тәуелді бөліну ERES мамандануына әкелуі мүмкін дифференциалды ақуыз өзара әрекеттесуіне негізделмейтінін анықтадық (S4 және S5 суреттер). Керісінше, біздің зерттеу нәтижелеріміз липидтерге негізделген ақуыз кластерлеуімен және кейіннен басқа жүктемелерді алып тастаумен басқарылатын балама жіктеу механизмін қолдайды. Біздің бақылауларымыз белгілі бір ERES-пен байланысты Gas1-GFP аймағында немесе кластерінде трансмембраналық бөлінетін ақуыз Mid2-iRFP жоқ екенін көрсетеді, бұл C26 керамидіне тәуелді GPI-AP кластерінің олардың тиісті ERES-ке енуін жеңілдететінін және сонымен бірге трансмембраналық бөлінулерді алып тастайтынын көрсетеді. Секрециялар осы нақты ERES-ке енеді (1 және 2 суреттер). Керісінше, ER мембранасында C18-C16 керамидтерінің болуы GPI-AP аймақтарын немесе кластерлерін түзуге әкелмейді, сондықтан олар трансмембраналық бөлінетін ақуыздарды сол ERES-ке алып тастамайды немесе алмастырмайды (3 және 4 суреттер). Сондықтан, біз C26 керамидінің белгілі бір ЭРЭС-пен байланысқан ақуыздардың кластерленуін жеңілдету арқылы бөліну мен жіктеуді басқаратынын ұсынамыз.
C26 керамидіне тәуелді кластерлеуге белгілі бір ER аймағына қалай қол жеткізуге болады? Мембраналық керамидтің бүйірден бөліну үрдісі GPI-AP және C26 керамидінің қысқа және қанықпаған глицеролипидтерді қамтитын ER мембранасының тұрақты емес липидтік ортасында шағын және лезде реттелген липидтер түзуіне әкелуі мүмкін. Сапа кластерлері (17, 18). Бұл шағын уақытша кластерлер p24 кешенімен байланысқаннан кейін үлкенірек, тұрақты кластерлерге одан әрі бірігуі мүмкін (34). Осыған сәйкес, біз C26 Gas1-GFP үлкенірек көрінетін кластерлерді қалыптастыру үшін p24 кешенімен әрекеттесуі керек екенін көрсеттік (3-сурет). p24 кешені - ашытқыдағы төрт түрлі p24 трансмембраналық ақуыздарынан тұратын гетерозиготалы олигомер (35), ол көпвалентті байланысты қамтамасыз етеді, бұл шағын GPI-AP кластерлерінің көлденең байланысына әкелуі мүмкін, осылайша үлкенірек тұрақты кластерді тудырады (34). GPI-AP ақуыз эктодомендерінің өзара әрекеттесуі олардың агрегациясына да ықпал етуі мүмкін, бұл сүтқоректілердің поляризацияланған эпителий жасушаларындағы Гольджи тасымалы кезінде көрсетілген (36). Дегенмен, ER мембранасында C18-C16 керамиді болған кезде, p24 кешені Gas1-GFP-мен байланысқан кезде, үлкен бөлек кластерлер пайда болмайды. Негізгі механизм ұзын ацил тізбекті керамидтің нақты физикалық және химиялық қасиеттеріне байланысты болуы мүмкін. Жасанды мембраналардың биофизикалық зерттеулері ұзын (C24) және қысқа (C18-C16) ацил тізбекті керамидтердің екеуі де фазаның бөлінуін тудыруы мүмкін болса да, тек ұзын ацил тізбекті керамидтер (C24) ғана пленканы қайта пішіндеу үшін жоғары қисықтық пен пленканың иілуін күшейте алатынын көрсетеді. Өзара сілтеме арқылы (17, 37, 38). Emp24 адам гомологы TMED2 трансмембраналық спиралінің цитоплазмалық бөлікшелерде C18 керамид негізіндегі сфингомиелинмен селективті түрде әрекеттесетіні көрсетілген (39). Молекулалық динамика (MD) модельдеуін қолдана отырып, біз C18 және C26 керамидтерінің екеуі де Emp24 трансмембраналық спиралінің цитоплазмалық бөлікшелерінің айналасында жиналатынын және олардың ұқсас артықшылықтары бар екенін анықтадық (S6-сурет). Айта кету керек, бұл Emp24 трансмембраналық спиралінің мембранадағы липидтердің асимметриялық таралуына әкелуі мүмкін екенін көрсетеді. Бұл сүтқоректілер жасушаларына негізделген жақында алынған нәтиже. Ұқсас MD модельдеулері эфир липидтерінің болуын да көрсетеді (40). Сондықтан, біз ER26 екі бөлікшесіндегі C26 керамидінің жергілікті түрде байытылған деп болжаймыз. Люминальды бөлікшелердегі GPI-AP көпвалентті p24-пен тікелей байланысқанда және цитоплазмалық бөлікшелердегі p24 айналасындағы C26 керамидінің жиналуына ықпал еткенде, ол ақуыздың агрегациясын және мембрана қисығын саусақтар арқылы тудыруы мүмкін (41), бұл GPI-AP-тың ERES-ке жақын орналасқан дискретті аймақтарға бөлінуіне әкеледі, бұл да ER мембранасының жоғары қисық аймақтарына қолайлы жағдай жасайды (42). Алдыңғы есептер ұсынылған механизмді қолдады (43, 44). Олиголектиндердің, патогендер немесе антиденелердің керамид негізіндегі гликосфинголипидтерге (GSL) плазма мембранасында көпвалентті байланысы GSL агрегациясының үлкен болуын тудырады, фазалық бөлінуді күшейтеді және мембрана деформациясы мен интернализациясын тудырады (44). Ивабучи және т.б. (43) Ұзын (C24), бірақ қысқа емес (C16) ацил тізбектерінің қатысуымен GSL лактозилцерамидімен байланысқан көпвалентті лиганд үлкен кластерлердің пайда болуын және мембраналық инвагинацияны тудыратыны, ал цитоплазмада Lyn арқылы жапырақшалардағы сигнал трансдукциясы байланысқан нейтрофилдердегі ацил тізбектерімен өзара байланысатыны анықталды.
Сүтқоректілердің поляризацияланған эпителий жасушаларында анти-Гольджи желісінің (TGN) апикальды плазмалық мембрана деңгейіне концентрациясы GPI-AP бөлінуін және сұрыпталуын басқарады (10, 45). Бұл агрегация GPI-AP олигомерленуімен (36) жүзеге асырылады, бірақ ол ашытқыда кездесетін керамид тізбегінің ұзындығына да байланысты болуы мүмкін. Сүтқоректілердің GPI-AP эфирлік липид негізіндегі якорьге ие болса да және оның химиялық құрылымы өте ұзын ацил тізбекті керамидтен өте өзгеше болса да, жақында жүргізілген зерттеу екі липидтің де эволюциялық тұрғыдан ұқсас физикалық және химиялық қасиеттері мен функциясы бар екенін анықтады (40). Сондықтан сүтқоректілер жасушаларындағы эфирлік липидтік бөлік ашытқыдағы C26 керамидіне ұқсас болуы мүмкін және оның рөлі мембранадағы ұзын тізбекті керамидпен байланысып, GPI-AP агрегациясы мен сұрыпталуын ілгерілету болып табылады. Бұл мүмкіндікті әлі де тікелей тексеру қажет болса да, бұрынғы зерттеулер ұзын ацил тізбекті керамидтің Гольджи денесіне тасымалдануы цитоплазмалық тасымалдау ақуыздарымен емес, ашытқы сияқты GPI якорьлерінің синтезіне байланысты екенін растайды. Сондықтан, эволюциялық консервативті механизм өте ұзын ацил тізбекті керамид пен GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) бір тасымалдау көпіршігінде селективті түрде бірге тасымалдай алатын сияқты.
Ашытқы мен сүтқоректілердің поляризацияланған эпителий жасуша жүйелерінде GPI-AP агрегациясы және басқа плазмалық мембрана ақуыздарынан бөлінуі жасуша бетіне жеткенге дейін жүреді. Паладино және т.б. (48) сүтқоректілердің поляризацияланған эпителий жасушаларының TGN-інде GPI-AP кластерленуі тек GPI-AP-тарды апикальды плазмалық мембранаға селективті жіктеу үшін ғана емес, сонымен қатар GPI-AP кластерленуін және оның биологиялық белсенділігін реттейтінін анықтады. Жасуша беті. Ашытқыда бұл зерттеу ER-дегі C26 керамидке тәуелді GPI-AP кластері плазмалық мембранадағы GPI-AP кластерінің кластерлік ұйымын және функционалдық белсенділігін реттей алатынын көрсетті (24, 49). Осы модельге сәйкес, GhLag1 жасушалары GPI ингибиторларына немесе жасуша қабырғасының тұтастығына әсер ететін дәрілерге аллергиясы бар (28), ал ашытқы жасушаларының жұптасуы кезінде проекцияланған ұштық керамидтің функционалды Gas1-GFP кластерлеріне қажеттілік (49) G-ны көрсетеді. hLag1 жасушаларының мүмкін физиологиялық салдары. GPI-AP қателігі. Дегенмен, жасуша бетінің функционалдық ұйымы липид ұзындығына негізделген сұрыптау әдісімен ЭР-дан бағдарламаланғанын одан әрі тексеру біздің болашақ зерттеулеріміздің тақырыбы болады.
Бұл жұмыста қолданылған Saccharomyces cerevisiae штамдары S1 кестесінде келтірілген. Тірі жасушаларды бейнелеуге арналған SCLIM MMY1583 және MMY1635 штамдары W303 фонында құрастырылған. Sec13-mCherry флуоресцентті ақуыз белгісімен экспрессияланатын бұл штамдар үлгі ретінде pFA6a плазмидасын пайдалана отырып, полимеразды тізбекті реакция (ПТР) негізіндегі әдісті қолдана отырып құрастырылған (23). GAL1 промоторының бақылауымен флуоресцентті ақуызбен белгіленген Mid2-iRFP экспрессияланатын штамм келесідей құрастырылған. pKTiRFP-KAN векторынан iRFP-KanMx тізбегінің ПТР күшейтуі (E. O'Shea сыйлығы, Addgene плазмид нөмірі 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; зерттеу ресурсының идентификаторы (RRID): Addgene_64687) Және эндогенді Mid2-нің С-терминалына енгізілген. Mid2-iRFP геномының тізбегі күшейтіліп, GAL1 промоторына клондалғаннан кейін, ол pRS306 интеграциялық плазмиданың Not I-Sac I сайтына интеграцияланды. Алынған pRGS7 плазмидасы URA3 локусына интеграциялану үшін Pst I-мен сызықтандырылды.
Gas1-GFP бірігу гені центромера (CEN) плазмидасында GAL1 промоторының бақылауымен экспрессияланады, ол келесідей құрастырылған. Gas1-GFP тізбегі pRS416-GAS1-GFP плазмидінен (24) (Л. Пополо сыйлығы) ПТР арқылы күшейтілді және CEN плазмидасы pBEVY-GL LEU2 (C сыйлығы) Xma I–Xho I сайтына клондалды. Миллер; Адджен плазмидасы нөмірі 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Алынған плазмидаға pRGS6 деген ат берілді. Axl2-GFP бірігу гені де pBEVY-GL LEU2 векторының GAL1 промоторының бақылауымен экспрессияланады және оның құрылысы келесідей. Axl2-GFP тізбегі pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидінен (23) ПТР арқылы күшейтілді және pBEVY-GL LEU2 векторының Bam HI-Pst I сайтына клондалды. Алынған плазмид pRGS12 деп аталды. Бұл зерттеуде қолданылған олигонуклеотидтердің тізбегі S2 кестесінде келтірілген.
Штамм көміртегі көзі ретінде 0,2% аденин және 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] бай ашытқы сығындысы ақуыз p (YP) ортасымен (1% ашытқы сығындысы және 2% ақуыз ept). (YPR)] немесе 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] немесе қоректік заттар үшін қажетті тиісті аминқышқылдары мен негіздерін толықтыру үшін синтетикалық минималды ортада (0,15% ашытқы азот негізі және 0,5% аммоний сульфаты) қосылды, ал көміртегі көзі ретінде 2% глюкоза (синтетикалық глюкоза минималды орта) немесе 2% галактоза (синтетикалық галактоза минималды орта) болды.
Нақты уақыттағы бейнелеу үшін GAL1 промоторының астындағы конструкцияны экспрессиялайтын температураға сезімтал sec31-1 мутант жасушалары YPR ортасында 24°C температурада түні бойы орташа логарифмдік фазаға дейін өсірілді. YPG-де 24°C температурада 1 сағат индукциялағаннан кейін, жасушалар SG-де 37°C температурада 30 минут инкубацияланды, содан кейін секреция блогынан босату үшін 24°C температураға ауыстырылды. Жасушаларды шыны слайдқа бекіту және SCLIM арқылы бейнелеу үшін конканавалин А қолданылды. SCLIM - Olympus IX-71 инверттелген флуоресценциялық микроскопы мен UPlanSApo 100×1.4 сандық диафрагмалық майлы линзасының (Olympus), жоғары жылдамдықты және жоғары сигнал-шу қатынасына ие айналмалы диск конфокальды сканерінің (Yokogawa Electric), арнайы спектрометрдің және арнайы салқындатудың үйлесімі. Жүйенің кескін күшейткіші (Hamamatsu Photonics) ×266.7 соңғы үлкейтуі бар үлкейткіш линза жүйесін және электрондарды көбейтетін зарядталған құрылғы камерасын (Hamamatsu Photonics) қамтамасыз ете алады (21). Кескінді алу арнайы бағдарламалық жасақтама (Yokogawa Electric) арқылы жүзеге асырылады. 3D кескіндер үшін біз объективті линзаны тігінен дірілдету үшін арнайы жасалған пьезоэлектрлік жетек қолдандық және оптикалық бөліктерді 100 нм қашықтықта стек түрінде жинадық. Z-стек кескіні 3D воксель деректеріне түрлендіріледі, ал айналмалы диск конфокальды микроскоп үшін қолданылатын теориялық нүкте таралу функциясы Volocity бағдарламалық жасақтамасы (PerkinElmer) арқылы деконволюцияны өңдеу үшін қолданылады. Жүкті қоса алғанда, ERES бірлескен орналасу талдауының шегін автоматты түрде анықтау үшін Volocity бағдарламалық жасақтамасын пайдалану арқылы өлшенді. Сызықтық сканерлеу талдауы MetaMorph бағдарламалық жасақтамасын (Molecular Devices) пайдаланып жүргізілді.
Статистикалық маңыздылықты анықтау үшін GraphPad Prism бағдарламалық жасақтамасын пайдаланыңыз. Екі жақты Стьюденттің t-тесті және кәдімгі бір жақты дисперсиялық талдау (ANOVA) сынағы үшін топтар арасындағы айырмашылықтар P <0,05 (*) мәніне айтарлықтай әсер етеді деп саналады.
Gas1-GFP флуоресценциялық микроскопиясы үшін логарифмдік фазалық жасушалар YPD-де түні бойы өсіріліп, центрифугалау арқылы жиналды, фосфат буферленген тұзды ерітіндімен екі рет жуылды және мұзда кем дегенде 15 минут инкубацияланды, содан кейін бұрын сипатталғандай микроскоп астында жүргізілді (24-бет). Алу үшін объективті линзамен, L5 (GFP) сүзгісімен, Hamamatsu камерасымен және Application Suite X (LAS X) бағдарламалық жасақтамасымен жабдықталған Leica DMi8 микроскопы (HCX PL APO 1003/1.40 майлы PH3 CS) пайдаланылды.
Үлгілер SDS үлгі буферімен 65°C температурада 10 минут бойы денатурацияланды, содан кейін SDS-полиакриламид гель электрофорезімен (PAGE) бөлінді. Иммуноблоттинг талдауы үшін әр жолаққа 10 мкл үлгі салынды. Бастапқы антидене: 1:3000 сұйылтылған қоянға арналған поликлоналды анти-Gas1, 1:500 сұйылтылған қоянға арналған поликлоналды анти-Emp24 және 1:3000 сұйылтылған қоянға арналған поликлоналды анти-GFP (Х. Ризманның сыйлығы) қолданыңыз. Тышқанның моноклоналды анти-Pgk1 антиденесін 1:5000 сұйылтылған күйінде қолданды (Дж. де ла Круздың сыйлығы). Екіншілік антидене: 1:3000 сұйылтылған ешкіге арналған қоянға қарсы G (IgG) конъюгацияланған хрен пероксидазасы (Pirce). HRP-конъюгацияланған ешкі тышқанына қарсы IgG 1:3000 сұйылту кезінде қолданылды (Пирс). Иммундық жауап аймағы SuperSignal West Pico реактивінің (Thermo Fisher Scientific) хемилюминесценция әдісімен байқалды.
(31)-де сипатталғандай, байытылған ER фракциясында табиғи иммунопреципитация эксперименті жүргізілді. Қысқаша айтқанда, ашытқы жасушаларын TNE буферімен [50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид және протеаза ингибиторының қоспасы) 600 нм (OD600) кезінде 100 оптикалық тығыздықта екі рет жуыңыз. Ол шыны моншақтармен сындырылды, содан кейін жасуша қалдықтары мен шыны моншақтар центрифугалау арқылы жойылды. Содан кейін супернатант 17 000 г температурада 4°C температурада 15 минут бойы центрифугаланды. Түйіршік TNE-де қайта суспензияланды және дигиталис сапонині 1% соңғы концентрацияға дейін қосылды. Суспензия 4°C температурада 1 сағат бойы айналыммен инкубацияланды, содан кейін ерімейтін компоненттер 13 000 г температурада 4°C температурада 60 минут бойы центрифугалау арқылы жойылды. Gas1-GFP иммунопреципитациясы үшін алдымен үлгіні бос агароз түйіршіктерімен (ChromoTek) 4°C температурада 1 сағат алдын ала инкубациялаңыз, содан кейін GFP-Trap_A (ChromoTek)-пен 4°C температурада 3 сағат инкубациялаңыз. Иммунопреципитацияланған түйіршіктер 0,2% дигоксигенин бар TNE ерітіндісімен бес рет жуылды, SDS үлгі буферімен элюцияланды, SDS-PAGE-де бөлінді және иммуноблоттау арқылы талданды.
(31)-де сипатталғандай, байытылған ЭҚ фракциясында көлденең байланысты анықтау жүргізілді. Қысқаша айтқанда, байытылған ЭҚ фракциясы 0,5 мМ дитиобиспен (сукцинимидил пропионаты) инкубацияланды (Пирс, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, АҚШ; 20°C, 20 мин). Айқас байланыстыру реакциясы глицин қосу арқылы басылды (50 мМ соңғы концентрация, 5 минут, 20°C).
Бұрын сипатталғандай (50), жабайы типтегі және GhLag1 штаммдарындағы керамидтің MS талдауы жүргізілді. Қысқасы, жасушалар YPD-де 30°C температурада экспоненциалды фазаға дейін (3-тен 4 OD600 бірлік/мл-ге дейін) өсірілді және 25×107 жасуша жиналды. Олардың метаболизмі трихлорсірке қышқылымен басылады. Экстракциялық еріткішті [этанол, су, эфир, пиридин және 4,2 Н аммоний гидроксиді (15:15:5:1:0,018 v/v)] және ішкі стандартты C17 керамиді (860517, Avanti полярлық липид) сапасының 1,2 нмольін пайдаланыңыз. Экстракцияның жеңіл сілтілі гидролизін жүргізу үшін монометиламин реагентін [метанол, су, n-бутанол және метиламин ерітіндісін (4:3:1:5 v/v)] пайдаланыңыз, содан кейін тұзсыздандыру үшін сумен қаныққан n-бутанолды қолданыңыз. Соңында, сығынды оң режимдегі еріткіште [хлороформ/метанол/су (2:7:1) + 5 мМ аммоний ацетаты] қайта ерітіліп, масс-спектрометрге енгізілді. Сфинголипид молекулаларын анықтау және сандық бағалау үшін көп реакциялы мониторинг (MRM) жүргізілді. TSQ Vantage үшінші реттік квадрупольді масс-спектрометрі (Thermo Fisher Scientific) липидтерді талдау үшін роботтық нанофолды ион көзі Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк)-мен жабдықталған. Соқтығысу энергиясы әрбір керамид санаты үшін оңтайландырылған. MS деректері оң режимде алынды. Әрбір биологиялық қайталау үшін липидтік сигнал үш тәуелсіз өлшеудің медианасы болып табылады.
(31)-де сипатталғандай, Gas1-GFP экспрессиялайтын жасушалар (800 × 107) табиғи иммунопреципитацияға ұшырады. Тазартылған Gas1-GFP SDS-PAGE арқылы бөлініп, поливинилиденфторидті (PVDF) мембранаға ауыстырылды. Ақуыз PVDF-ті амид қара түсімен бояу арқылы көрнекі түрде анықталды. Gas1-GFP жолағы PVDF-тен кесіліп, 5 рет метанолмен және бір рет сұйық хроматография-MS (LC-MS) сұйық сумен жуылды. Мембрана жолағын 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфермен және 500 мкл жаңа ерітілген 1 М натрий нитрит қоспасымен 37°C температурада 3 сағат бойы инкубациялау арқылы липидтік фракция Gas1-GFP-ден босатылып, лизиске ұшырайды. Глюкозамин мен инозитол арасындағы инозин фосфаты керамидінің бөлінуі (51). Осыдан кейін мембраналық жолақ LC-MS сұрыпты сумен төрт рет жуылып, бөлме температурасында кептіріліп, талдау жасалғанға дейін азот атмосферасында -80°C температурада сақталды. Бақылау ретінде әр тәжірибе үшін PVDF мембранасының бос үлгісі пайдаланылды. Gas1-GFP-ден алынған липид (50) сипатталғандай MS әдісімен талданды. Қысқасы, GPI-липиді бар PVDF жолақтары 75 мкл теріс зең еріткішінде [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммоний ацетаты] қайта ерітіліп, сфинголипид түрлерінің электроспрей иондалуы (ESI)-MRM/MS талдауынан (TSQ Vantage) өтті. Бұл жағдайда MS деректері теріс ион режимінде алынды.
Бұрын айтылғандай, GPI якорінің липидті бөлігі [3H]-инозитолмен белгіленген GPI-AP-тан (16) бөлінді. Липидтер еріткіш жүйесін (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) пайдаланып жұқа қабатты хроматография арқылы бөлінді және FLA-7000 (Fujifilm) көмегімен көрнекі түрде көрсетілді.
Gas1-GFP (600 × 107) экспрессиялайтын жасушалар TNE буфері бар TNE буферімен екі рет жуылып, шыны моншақтармен сындырылды, содан кейін жасуша қалдықтары мен шыны моншақтарынан арылу үшін центрифугаланды. Содан кейін супернатант 17 000 г температурада 4°C температурада 1 сағат бойы центрифугаланды. Түйіршік TNE-де жуылып, 0,2% дигиталис сапонині бар TNE-де 1 U PI-PLC (Invitrogen) ерітіндісімен 37°C температурада 1 сағат бойы инкубацияланды. Ферментпен өңдеуден кейін мембрана 17 000 г температурада 4°C температурада 1 сағат бойы центрифугалау арқылы алынып тасталды. Gas1-GFP иммунопреципитациясы үшін супернатант GFP-Trap_A (ChromoTek) ерітіндісімен 4°C температурада түні бойы инкубацияланды. SDS-PAGE арқылы бөлінген тазартылған Gas1-GFP Coomassie бриллиант көк түсімен боялды. Gas1-GFP бояу жолағы су құбырының айналасындағы сұрдан кесіліп алынды, содан кейін йодоацетамидпен алкилдеуден және дитиотреитолмен тотықсыздандырудан кейін трипсинмен гель ішіндегі қорыту жүргізілді. ГПИ-гликандармен триптикалық пептидтер мен пептидтерді экстракциялау және кептіру. Кептірілген пептид 20 мкл суда ерітілді. LC-ге бір бөлігін (8 мкл) енгізіңіз. Белгілі бір градиент жағдайында пептидтерді бөлу үшін октадецилсилан (ODS) бағаны (Develosil 300ODS-HG-5; ішкі диаметрі 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айчи префектурасы, Жапония) пайдаланылды. Жылжымалы фаза - А еріткіші (0,08% құмырсқа қышқылы) және В еріткіші (80% ацетонитрилдегі 0,15% құмырсқа қышқылы). Accela HPLC жүйесі (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) бағанды ​​А еріткішімен 55 минут ішінде 50 мкл мин-1 ағын жылдамдығымен элюциялау үшін пайдаланылды, содан кейін B еріткішінің концентрациясы 40%-ға дейін арттырылды. , Америка Құрама Штаттары). Элюат ESI ион көзіне үздіксіз енгізілді, ал триптикалық пептидтер мен GPI-гликандары бар пептидтер LTQ Orbitrap XL (гибридті сызықтық ион тұзағы-орбитрап масс-спектрометрі; Thermo Fisher Scientific) көмегімен талданды. MS қондырғысында капиллярлық көздің кернеуі 4,5 кВ-қа орнатылды, ал тасымалдаушы капиллярдың температурасы 300°C температурада сақталды. Капиллярлық кернеу мен түтік линзасының кернеуі сәйкесінше 15 В және 50 В-қа орнатылды. MS деректері оң иондық режимде (ажырату мүмкіндігі 60 000; масса дәлдігі миллионға 10 бөлік) 300/м/з масса/заряд қатынасы (м/з) 3000 массалық диапазонында алынды. MS/MS деректері LTQ Orbitrap XL [деректер тәуелді болатын алғашқы 3 сан, соқтығысудан туындаған диссоциация (CID)] ішіндегі иондық тұзақ арқылы алынды.
MD модельдеулері GROMACS (52) бағдарламалық жасақтамасын және MARTINI 2 күш өрісін (53-55) пайдаланып жүргізілді. Содан кейін CHARMM GUI мембрана құрастырушысы (56, 57) диолеойлфосфатидилхолин (DOPC) және Cer C18 немесе DOPC және Cer C26 бар қос қабатты құру үшін пайдаланылды. Cer C26 топологиясы мен координаттары сфингозин құйрығынан артық моншақтарды алып тастау арқылы DXCE-ден алынады. Қос қабатты теңестіріп, оны іске қосу үшін төменде сипатталған процесті пайдаланыңыз, содан кейін Emp24 бар жүйені құру үшін жүйенің соңғы координаттарын пайдаланыңыз. Ашытқы Emp24 трансмембраналық домені (173-тен 193-ке дейінгі қалдықтар) визуалды MD (VMD) құралының молекулалық құрылымын (58) пайдаланып α-спираль түрінде құрылды. Содан кейін, қабаттасқан липидтерді алып тастағаннан кейін, ақуыз ірі түйіршіктеліп, CHARMM GUI көмегімен қос қабатқа енгізілді. Соңғы жүйеде 1202 DOPC және 302 Cer C26 немесе 1197 DOPC және 295 Cer C18 және Emp24 бар. Жүйені 0,150 М концентрациясына дейін иондаңыз. Екі қос қабатты композиция үшін төрт тәуелсіз қайталау жасалды.
Липидті қос қабат CHARMM GUI процесін пайдаланып теңестіріледі, ол 405 000 қадамды азайтуды және содан кейін теңестіруді қамтиды, мұнда позиция шектеулері біртіндеп азаяды және жойылады, ал уақыт қадамы 0,005 ps-тен 0,02 ps-ке дейін артады. Тепе-теңдіктен кейін ол 0,02 ps уақыт қадамымен 6 мкс шығарады. Emp24 енгізгеннен кейін, жүйені азайту және теңестіру үшін сол CHARMM GUI процесін пайдаланыңыз, содан кейін өндірісте 8 секунд жұмыс істеңіз.
Барлық жүйелер үшін теңдестіру процесінде қысым Берендсен баростатымен (59), ал өндіріс процесінде қысым Парринелло-Рахман баростатымен (60) басқарылады. Барлық жағдайларда орташа қысым 1 барды құрайды және жартылай изотропты қысымды байланыстыру схемасы қолданылады. Теңгерім және өндіріс процесінде ақуыз, липид және еріткіш бөлшектерінің температурасын сәйкесінше байланыстыру үшін жылдамдықты қайта калибрлеу мүмкіндігі бар термостат (61) қолданылады. Барлық жұмыс барысында мақсатты температура 310 К құрайды. Байланыспайтын өзара әрекеттесу 0,005 буферлік төзімділігі бар Verlet схемасын пайдаланып жұптастыру тізімін жасау арқылы есептеледі. Кулон мүшесі реакция өрісі және 1,1 нм кесу қашықтығы арқылы есептеледі. Вандер-Ваальс мүшесі 1,1 нм кесу қашықтығы бар кесу схемасын пайдаланады, ал Verlet кесу схемасы потенциалды дрейф үшін қолданылады (62).
VMD көмегімен DOPC фосфат түйіршіктері немесе керамид AM1 түйіршіктері мен ақуыз арасындағы толқын ұзындығының қиылысу ұзындығы 0,7 нм құрайды, ал ақуызбен әрекеттесетін липидтер саны есептеледі. Келесі формулаға сәйкес, (63) формуласындағыдай сарқылу-байыту (DE) коэффициентін есептеңіз: DE факторы = (ақуыздағы жалпы липидтердің мөлшері 0,7) ақуыздағы 0,7 (жалпы липидтердегі Cer мөлшері)
Есеп берілген мән орташа мән ретінде алынады, ал қателік жолақтары SE-нің төрт тәуелсіз көшірмесі болып табылады. DE факторының статистикалық маңыздылығы t сынағы [(орташа DE-фактор-1)/SE] арқылы есептеледі. P мәнін бір жақты үлестірімнен есептеңіз.
GROMACS құралы іздің соңғы 250 н ішінде Emp24 бар жүйенің 2D бүйірлік тығыздық картасын есептеу үшін пайдаланылды. Керамидтің байыту/таусылу картасын алу үшін Cer тығыздық картасы Cer және DOPC картасының қосындысына, содан кейін денедегі Cer концентрациясына бөлінеді. Сол түсті карта шкаласы қолданылады.
Осы мақалаға қосымша материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 сайтынан қараңыз.
Бұл Creative Commons Attribution-Non-Commercial лицензиясының шарттары бойынша таратылатын ашық қолжетімді мақала, ол кез келген құралда пайдалануға, таратуға және көбейтуге мүмкіндік береді, егер соңғы пайдалану коммерциялық пайда табу үшін болмаса және түпнұсқа жұмыс дұрыс болса. Сілтеме.
Ескертпе: Біз сізден тек электрондық пошта мекенжайыңызды беруіңізді сұраймыз, сонда сіз парақшаға ұсынған адам сіздің электрондық поштаны көруін қалайтыныңызды және оның спам емес екенін білуі керек. Біз ешқандай электрондық пошта мекенжайларын тіркемейміз.
Бұл сұрақ сіздің келуші екеніңізді тексеру және спамның автоматты түрде жіберілуін болдырмау үшін қолданылады.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Анаэро-Сергиес (Ло Мариаес) Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D жоғары ажыратымдылықтағы нақты уақыт режиміндегі бейнелеу селективті шығыс орындарында ақуызды сұрыптау үшін керамид тізбегінің ұзындығының маңыздылығын көрсетеді.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Анаэро-Сергиес (Ло Мариаес) Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D жоғары ажыратымдылықтағы нақты уақыт режиміндегі бейнелеу селективті шығыс орындарында ақуызды сұрыптау үшін керамид тізбегінің ұзындығының маңыздылығын көрсетеді.
©2020 Америка ғылымды дамыту қауымдастығы. барлық құқықтар қорғалған. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef және COUNTER серіктесі болып табылады. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.