nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін браузердің соңғы нұсқасын пайдалануды (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіруді) ұсынамыз. Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін бұл сайтта стильдер немесе JavaScript болмайды.
Күкіртсутектің (H2S) адам ағзасына көптеген физиологиялық және патологиялық әсерлері бар. Натрий гидросульфиді (NaHS) биологиялық тәжірибелерде H2S әсерін бағалау үшін фармакологиялық құрал ретінде кеңінен қолданылады. NaHS ерітінділерінен H2S жоғалуы бірнеше минутты ғана алса да, кейбір жануарларға жүргізілген зерттеулерде NaHS ерітінділері ауыз судағы H2S үшін донорлық қосылыстар ретінде қолданылды. Бұл зерттеуде кейбір авторлар ұсынғандай, егеуқұйрық/тышқан бөтелкелерінде дайындалған 30 мкМ NaHS концентрациясы бар ауыз су кем дегенде 12-24 сағат бойы тұрақты болып қала ала ма, жоқ па, зерттелді. Ауыз суда NaHS (30 мкМ) ерітіндісін дайындап, оны дереу егеуқұйрық/тышқан су бөтелкелеріне құйыңыз. Метилен көк әдісін қолдана отырып, сульфид мөлшерін өлшеу үшін сынамалар су бөтелкесінің ұшынан және ішінен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 және 24 сағат ішінде алынды. Сонымен қатар, еркек және аналық егеуқұйрықтарға екі апта бойы NaHS (30 мкМ) енгізілді, ал сарысудағы сульфид концентрациясы бірінші аптада және екінші аптаның соңында күнара өлшенді. Су бөтелкесінің ұшынан алынған үлгідегі NaHS ерітіндісі тұрақсыз болды; ол 12 және 24 сағаттан кейін сәйкесінше 72% және 75%-ға төмендеді. Су бөтелкелерінің ішінен алынған үлгілерде NaHS мөлшерінің төмендеуі 2 сағат ішінде айтарлықтай болған жоқ; дегенмен, ол 12 және 24 сағаттан кейін сәйкесінше 47% және 72%-ға төмендеді. NaHS енгізу еркек және аналық егеуқұйрықтардың сарысудағы сульфид деңгейіне әсер еткен жоқ. Қорытындылай келе, ауыз судан дайындалған NaHS ерітінділерін H2S донорлығы үшін пайдалануға болмайды, себебі ерітінді тұрақсыз. Бұл енгізу жолы жануарларды тұрақты емес және күтілгеннен аз мөлшерде NaHS әсеріне ұшыратады.
Күкіртсутек (H2S) 1700 жылдан бері токсин ретінде қолданылып келеді; дегенмен, оның эндогендік биосигнал молекуласы ретіндегі мүмкін рөлін 1996 жылы Абе мен Кимура сипаттаған. Соңғы үш онжылдықта H2S-тің әртүрлі адам жүйелеріндегі көптеген функциялары анықталды, бұл H2S донор молекулаларының белгілі бір ауруларды емдеуде немесе басқаруда клиникалық қолданылуы мүмкін екенін түсінуге әкелді; жақында жарияланған шолу үшін Чирино және т.б. қараңыз.
Натрий гидросульфиді (NaHS) көптеген жасуша дақылдары мен жануарларға жүргізілген зерттеулерде H2S әсерін бағалау үшін фармакологиялық құрал ретінде кеңінен қолданылды5,6,7,8. Дегенмен, NaHS ерітіндіде H2S/HS-ге тез айналатындықтан, полисульфидтермен оңай ластанатындықтан және оңай тотығатындықтан және буланатындықтан идеалды H2S доноры емес4,9. Көптеген биологиялық тәжірибелерде NaHS суда ериді, бұл H2S10,11,12 пассивті булануына және жоғалуына, H2S11,12,13 өздігінен тотығуына және фотолизге14 әкеледі. Бастапқы ерітіндідегі сульфид H2S11 булануына байланысты өте тез жоғалады. Ашық ыдыста H2S жартылай ыдырау кезеңі (t1/2) шамамен 5 минутты құрайды, ал оның концентрациясы минутына шамамен 13%-ға төмендейді10. NaHS ерітінділерінен күкіртсутектің жоғалуы бірнеше минутты ғана алса да, кейбір жануарларға жүргізілген зерттеулерде NaHS ерітінділері ауыз судағы күкіртсутек көзі ретінде 1-21 апта бойы қолданылып, әрбір 12-24 сағат сайын NaHS бар ерітіндіні ауыстырып отырды.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Бұл тәжірибе ғылыми зерттеу принциптеріне сәйкес келмейді, себебі дәрілік заттардың дозалары оларды басқа түрлерде, әсіресе адамдарда қолдануға негізделуі керек.27
Биомедицинадағы клиникаға дейінгі зерттеулер пациенттерге күтім жасау сапасын немесе емдеу нәтижелерін жақсартуға бағытталған. Дегенмен, жануарларға жүргізілген зерттеулердің көпшілігінің нәтижелері әлі адамдарға аударылған жоқ28,29,30. Бұл трансляциялық сәтсіздіктің себептерінің бірі - жануарларға жүргізілген зерттеулердің әдіснамалық сапасына назар аударылмауы30. Сондықтан, бұл зерттеудің мақсаты кейбір зерттеулерде айтылғандай немесе ұсынылғандай, егеуқұйрық/тышқан су бөтелкелерінде дайындалған 30 мкМ NaHS ерітінділерінің ауыз суда 12-24 сағат бойы тұрақты болып қала алатындығын зерттеу болды.
Бұл зерттеудегі барлық эксперименттер Ирандағы зертханалық жануарларды күту және пайдалану бойынша жарияланған нұсқауларға сәйкес жүргізілді31. Бұл зерттеудегі барлық эксперименттік есептер де ARRIVE нұсқауларына сәйкес келді32. Шахид Бехешти атындағы медициналық ғылымдар университетінің Эндокриндік ғылымдар институтының Этика комитеті осы зерттеудегі барлық эксперименттік процедураларды мақұлдады.
Мырыш ацетаты дигидраты (CAS: 5970-45-6) және сусыз темір хлориді (CAS: 7705-08-0) Biochem, Chemopahrama (Козне-сюр-Луар, Франция) компанияларынан сатып алынды. Натрий гидросульфид гидраты (CAS: 207683-19-0) және N,N-диметил-п-фенилендиамин (DMPD) (CAS: 535-47-0) Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, АҚШ) компанияларынан сатып алынды. Изофлуран Piramal (Бетлехем, Пенсильвания, АҚШ) компанияларынан сатып алынды. Тұз қышқылы (HCl) Merck (Дармштадт, Германия) компанияларынан сатып алынды.
Ауыз суда NaHS (30 мкМ) ерітіндісін дайындап, оны дереу егеуқұйрық/тышқан су бөтелкелеріне құйыңыз. Бұл концентрация H2S көзі ретінде NaHS қолданылған көптеген басылымдарға негізделген; Талқылау бөлімін қараңыз. NaHS - әртүрлі мөлшерде гидратталған суды (яғни, NaHS•xH2O) қамтуы мүмкін гидратталған молекула; өндірушінің мәліметтері бойынша, біздің зерттеуімізде қолданылған NaHS пайызы 70,7% құрады (яғни, NaHS•1,3 H2O), және біз есептеулерімізде осы мәнді ескердік, мұнда біз сусыз NaHS молекулалық салмағы болып табылатын 56,06 г/моль молекулалық салмағын пайдаландық. Гидратталған су (кристалдану суы деп те аталады) - кристалдық құрылымды құрайтын су молекулалары33. Гидраттардың ангидраттарға қарағанда әртүрлі физикалық және термодинамикалық қасиеттері бар34.
Ауыз суға NaHS қоспас бұрын, еріткіштің рН мәнін және температурасын өлшеңіз. NaHS ерітіндісін дереу жануар торындағы егеуқұйрық/тышқан су бөтелкесіне құйыңыз. Сульфид мөлшерін өлшеу үшін сынамалар су бөтелкесінің ұшынан және ішінен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 және 24 сағат ішінде алынды. Сульфидті өлшеу әрбір сынамадан кейін бірден жүргізілді. Біз сынамаларды түтіктің ұшынан алдық, себебі кейбір зерттеулер су түтігінің кішкентай тесік өлшемі H2S булануын азайта алатынын көрсетті15,19. Бұл мәселе бөтелкедегі ерітіндіге де қатысты сияқты. Дегенмен, булану жылдамдығы жоғары және өзін-өзі тотықтыратын су бөтелкесінің мойнындағы ерітінді үшін бұлай болған жоқ; шын мәнінде, жануарлар алдымен осы суды ішті.
Зерттеуде аталық және аналық Вистар егеуқұйрықтары пайдаланылды. Егеуқұйрықтар полипропилен торларында (әр торда 2-3 егеуқұйрық) стандартты жағдайларда (температура 21-26 °C, ылғалдылық 32-40%) 12 сағат жарықта (таңғы 7-ден кешкі 7-ге дейін) және 12 сағат қараңғылықта (кешкі 7-ден таңғы 7-ге дейін) ұсталды. Егеуқұйрықтар кран суына еркін қол жеткізді және стандартты тамақпен (Хорак Дам Парс компаниясы, Тегеран, Иран) қоректенді. Жасы сәйкес келетін (6 айлық) аналық (n=10, дене салмағы: 190–230 г) және аталық (n=10, дене салмағы: 320–370 г) Вистар егеуқұйрықтары кездейсоқ түрде бақылау және NaHS (30 мкМ) өңделген топтарға бөлінді (әр топта n=5). Іріктеу көлемін анықтау үшін біз бұрынғы тәжірибе мен қуат талдауын біріктіретін KISS (Қарапайым, ақымақ) тәсілін қолдандық35. Алдымен біз 3 егеуқұйрыққа пилоттық зерттеу жүргізіп, сарысудағы жалпы сульфидтің орташа деңгейін және стандартты ауытқуды (8,1 ± 0,81 мкМ) анықтадық. Содан кейін, 80% қуатты ескере отырып және екі жақты 5% маңыздылық деңгейін қабылдай отырып, біз эксперименттік жануарлардың үлгі мөлшерін есептеу үшін Фестинг ұсынған алдын ала анықталған мәнмен 2,02 стандартталған әсер мөлшеріне сәйкес келетін алдын ала үлгі мөлшерін (n = 5 алдыңғы әдебиеттерге негізделген) анықтадық35. Бұл мәнді SD-ге (2,02 × 0,81) көбейткеннен кейін, болжамды анықталатын әсер мөлшері (1,6 мкМ) 20% болды, бұл қолайлы. Бұл n = 5/топ топтар арасындағы 20% орташа өзгерісті анықтау үшін жеткілікті екенін білдіреді. Егеуқұйрықтар Excel бағдарламалық жасақтамасының кездейсоқ функциясын пайдаланып бақылау және NaSH-мен өңделген топтарға кездейсоқ бөлінді 36 (қосымша 1-сурет). Нәтиже деңгейінде соқырлық жүргізілді, ал биохимиялық өлшеулерді жүргізген зерттеушілер топтық тапсырмалар туралы білмеді.
Екі жыныстағы NaHS топтары да ауыз суда дайындалған 30 мкМ NaHS ерітіндісімен 2 апта бойы өңделді; жаңа ерітінді әр 24 сағат сайын беріліп, дене салмағы өлшенді. Бірінші және екінші аптаның соңында күнара барлық егеуқұйрықтардың құйрық ұштарынан изофлуран анестезиясымен қан үлгілері алынды. Қан үлгілері 3000 г температурада 10 минут бойы центрифугаланды, сарысу бөлініп, сарысу мочевинасын, креатининді (Cr) және жалпы сульфидті кейіннен өлшеу үшін –80°C температурада сақталды. Сарысу мочевинасы ферментативті уреаза әдісімен анықталды, ал сарысу креатинині фотометриялық Джаффе әдісімен коммерциялық қолжетімді жинақтарды (Man Company, Тегеран, Иран) және автоматты анализаторды (Selectra E, сериялық нөмірі 0-2124, Нидерланды) пайдаланып анықталды. Мочевина мен Cr үшін вариацияның ішкі және аралық коэффициенттері 2,5%-дан аз болды.
Метилен көк (МБ) әдісі ауыз судағы және NaHS бар сарысудағы жалпы сульфидті өлшеу үшін қолданылады; МБ - сулы ерітінділердегі және биологиялық үлгілердегі сульфидті өлшеудің ең көп қолданылатын әдісі11,37. МБ әдісін жалпы сульфид пулын38 бағалау және сулы фазада H2S, HS- және S2 түріндегі бейорганикалық сульфидтерді39 өлшеу үшін пайдалануға болады. Бұл әдісте күкірт мырыш ацетаты қатысуымен мырыш сульфиді (ZnS) ретінде тұндырылады11,38. Мырыш ацетатының тұндыруы сульфидтерді басқа хромофорлардан бөлудің ең кең таралған әдісі11. ZnS қатты қышқылдық жағдайда HCl11 көмегімен қайта ерітілді. Сульфид DMPD-мен стехиометриялық қатынаста 1:2 қатынасында әрекеттесіп, темір хлориді (Fe3+ тотықтырғыш ретінде әрекет етеді) катализдейді, ол 670 нм40,41 спектрофотометриялық түрде анықталатын МБ бояғышын түзеді. МБ әдісінің анықтау шегі шамамен 1 мкМ11 құрайды.
Бұл зерттеуде әрбір үлгіден (ерітінді немесе сарысу) 100 мкл түтікке қосылды; содан кейін 200 мкл мырыш ацетаты (дистилденген суда 1% w/v), 100 мкл DMPD (7,2 М HCl-де 20 мМ) және 133 мкл FeCl3 (1,2 М HCl-де 30 мМ) қосылды. Қоспа қараңғы жерде 37°C температурада 30 минут инкубацияланды. Ерітінді 10 000 г жылдамдықпен 10 минут центрифугаланды, ал супернатанттың абсорбциясы микропластиналық оқу құрылғысын (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, АҚШ) пайдаланып 670 нм толқын ұзындығында оқылды. Сульфид концентрациясы ddH2O-дағы NaHS (0–100 мкМ) калибрлеу қисығын пайдаланып анықталды (2-қосымша сурет). Өлшеулер үшін пайдаланылған барлық ерітінділер жаңа дайындалған. Сульфидті өлшеулер үшін талдау ішіндегі және талдауаралық вариация коэффициенттері сәйкесінше 2,8% және 3,4% құрады. Біз сондай-ақ натрий тиосульфаты бар ауыз су мен сарысу үлгілерінен алынған жалпы сульфидті байытылған үлгі әдісін қолдана отырып анықтадық42. Натрий тиосульфаты бар ауыз су мен сарысу үлгілерінің алынуы сәйкесінше 91 ± 1,1% (n = 6) және 93 ± 2,4% (n = 6) құрады.
Статистикалық талдау Windows үшін GraphPad Prism бағдарламалық жасақтамасының 8.0.2 нұсқасын (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, АҚШ, www.graphpad.com) пайдаланып жүргізілді. NaHS қосқанға дейін және одан кейін ауыз судың температурасы мен рН мәнін салыстыру үшін жұптасқан t-тест қолданылды. NaHS құрамындағы ерітіндідегі H2S жоғалуы бастапқы сіңірілуден пайыздық төмендеу ретінде есептелді, ал жоғалтудың статистикалық тұрғыдан маңызды екенін бағалау үшін біз бір жақты қайталанатын өлшемді ANOVA, содан кейін Даннетттің көптік салыстыру сынағын жүргіздік. Дене салмағы, сарысу мочевинасы, сарысу креатинині және уақыт өте келе жалпы сарысу сульфиді бақылау және NaHS-пен өңделген әртүрлі жыныстағы егеуқұйрықтар арасында екі жақты аралас (ішкі) ANOVA, содан кейін Бонферрони пост-хок сынағын қолдану арқылы салыстырылды. Екі жақты P мәндері < 0,05 статистикалық тұрғыдан маңызды деп саналды.
Ауыз судың рН мәні NaHS қосқанға дейін 7,60 ± 0,01 және NaHS қосқаннан кейін 7,71 ± 0,03 болды (n = 13, p = 0,0029). Ауыз судың температурасы 26,5 ± 0,2 болды және NaHS қосқаннан кейін 26,2 ± 0,2 дейін төмендеді (n = 13, p = 0,0128). Ауыз суда 30 мкМ NaHS ерітіндісін дайындап, су бөтелкесінде сақтаңыз. NaHS ерітіндісі тұрақсыз және оның концентрациясы уақыт өте келе төмендейді. Су бөтелкесінің мойнынан сынама алған кезде бірінші сағат ішінде айтарлықтай төмендеу (68,0%) байқалды, ал ерітіндідегі NaHS мөлшері 12 және 24 сағаттан кейін сәйкесінше 72% және 75%-ға төмендеді. Су бөтелкелерінен алынған сынамаларда NaHS мөлшерінің төмендеуі 2 сағатқа дейін айтарлықтай болған жоқ, бірақ 12 және 24 сағаттан кейін сәйкесінше 47% және 72%-ға төмендеді. Бұл деректер ауыз суда дайындалған 30 мкМ ерітіндідегі NaHS пайызының сынама алу орнына қарамастан, 24 сағаттан кейін бастапқы мәннің шамамен төрттен біріне дейін төмендегенін көрсетеді (1-сурет).
NaHS ерітіндісінің (30 мкМ) егеуқұйрық/тышқан бөтелкелеріндегі ауыз судағы тұрақтылығы. Ерітінді дайындалғаннан кейін, су бөтелкесінің ұшынан және ішінен сынамалар алынды. Деректер орташа ± SD (n = 6/топ) ретінде көрсетілген. * және #, 0 уақытпен салыстырғанда P < 0,05. Су бөтелкесінің фотосуретінде ұшы (ашылуымен) және бөтелкенің корпусы көрсетілген. Ұштың көлемі шамамен 740 мкл.
Жаңа дайындалған 30 мкМ ерітіндідегі NaHS концентрациясы 30,3 ± 0,4 мкМ болды (диапазоны: 28,7–31,9 мкМ, n = 12). Дегенмен, 24 сағаттан кейін NaHS концентрациясы төменгі мәнге дейін төмендеді (орташа: 3,0 ± 0,6 мкМ). 2-суретте көрсетілгендей, егеуқұйрықтар ұшыраған NaHS концентрациясы зерттеу кезеңінде тұрақты болған жоқ.
Аналық егеуқұйрықтардың дене салмағы уақыт өте келе айтарлықтай өсті (бақылау тобында 205,2 ± 5,2 г-нан 213,8 ​​± 7,0 г-ға дейін және NaHS-пен емделген топта 204,0 ± 8,6 г-нан 211,8 ± 7,5 г-ға дейін); дегенмен, NaHS емі дене салмағына әсер еткен жоқ (3-сурет). Аталық егеуқұйрықтардың дене салмағы уақыт өте келе айтарлықтай өсті (бақылау тобында 338,6 ± 8,3 г-нан 352,4 ± 6,0 г-ға дейін және NaHS-пен емделген топта 352,4 ± 5,9 г-нан 363,2 ± 4,3 г-ға дейін); дегенмен, NaHS емі дене салмағына әсер еткен жоқ (3-сурет).
NaHS (30 мкМ) енгізгеннен кейін аналық және аталық егеуқұйрықтардың дене салмағының өзгеруі. Деректер орташа ± SEM ретінде ұсынылған және Bonferroni post hoc сынағымен екі жақты аралас (аралық) дисперсиялық талдауды қолдану арқылы салыстырылды. Әр топтағы әр жыныстан n = 5.
Зерттеу барысында бақылау тобында және NaSH-мен өңделген егеуқұйрықтарда сарысудағы мочевина мен креатинфосфат концентрациялары салыстырмалы болды. Сонымен қатар, NaSH-мен емдеу сарысудағы мочевина мен креатинхром концентрацияларына әсер еткен жоқ (1-кесте).
Бақылау және NaHS-пен өңделген еркек (8,1 ± 0,5 мкМ vs. 9,3 ± 0,2 мкМ) және аналық (9,1 ± 1,0 мкМ vs. 6,1 ± 1,1 мкМ) егеуқұйрықтарда сарысудағы жалпы сульфидтің бастапқы концентрациясы салыстырмалы болды. NaHS-ті 14 күн бойы енгізу еркек немесе аналық егеуқұйрықтардың сарысудағы жалпы сульфид деңгейіне әсер еткен жоқ (4-сурет).
NaHS (30 мкМ) енгізгеннен кейін аталық және аналық егеуқұйрықтардың сарысудағы жалпы сульфид концентрациясының өзгеруі. Деректер орташа ± SEM ретінде ұсынылған және Bonferroni post hoc сынағымен екі жақты аралас (ішкі-ішкі) дисперсиялық талдауды қолдану арқылы салыстырылды. Әрбір жыныс, n = 5/топ.
Бұл зерттеудің негізгі қорытындысы - құрамында NaHS бар ауыз судың тұрақсыздығы: егеуқұйрық/тышқан су бөтелкелерінің ұшынан және ішінен сынама алғаннан кейін 24 сағаттан кейін бастапқы жалпы сульфид мөлшерінің тек төрттен бір бөлігін анықтауға болады. Сонымен қатар, егеуқұйрықтар NaHS ерітіндісіндегі H2S жоғалуына байланысты тұрақсыз NaHS концентрациясына ұшырады, ал ауыз суға NaHS қосу дене салмағына, сарысудағы мочевина мен креатин хромына немесе сарысудағы жалпы сульфидке әсер еткен жоқ.
Бұл зерттеуде ауыз суда дайындалған 30 мкМ NaHS ерітінділерінен H2S жоғалу жылдамдығы сағатына шамамен 3% құрады. Буферлі ерітіндіде (10 мМ PBS-тегі 100 мкМ натрий сульфиді, рН 7,4) сульфид концентрациясының 8 сағат ішінде уақыт өте келе 7%-ға төмендегені туралы хабарланды11. Біз бұған дейін NaHS ішперде ішіне енгізуді ауыз судағы 54 мкМ NaHS ерітіндісінен сульфид жоғалу жылдамдығы сағатына шамамен 2,3% құрағанын хабарлау арқылы қорғаған болатынбыз (дайындаудан кейінгі алғашқы 12 сағатта сағатына 4% және соңғы 12 сағатта сағатына 1,4%)8. Бұрынғы зерттеулер43 NaHS ерітінділерінен H2S тұрақты жоғалуын, негізінен булану мен тотығу салдарынан анықтады. Көпіршіктер қосылмаса да, қор ерітіндісіндегі сульфид H2S булануынан тез жоғалады11. Зерттеулер шамамен 30-60 секундқа созылатын сұйылту процесі кезінде H2S шамамен 5-10% булану салдарынан жоғалатынын көрсетті6. Ерітіндіден H2S булануын болдырмау үшін зерттеушілер ерітіндіні ақырын араластыру12, негізгі ерітіндіні пластикалық пленкамен жабу6 және ерітіндінің ауаға әсерін азайту сияқты бірнеше шараларды қабылдады, себебі H2S булану жылдамдығы ауа-сұйықтық шекарасына байланысты.13 H2S-тің өздігінен тотығуы негізінен судағы қоспалар болып табылатын өтпелі металл иондарының, әсіресе темір темірдің әсерінен болады.13 H2S тотығуы полисульфидтердің (коваленттік байланыстармен байланысқан күкірт атомдары)11 түзілуіне әкеледі. Тотығуын болдырмау үшін құрамында H2S бар ерітінділер оттегісіз еріткіштерде дайындалады44,45, содан кейін оттегісізденуді қамтамасыз ету үшін 20-30 минут бойы аргон немесе азотпен тазартылады.11,12,37,44,45,46 Диэтилентриаминпентасірке қышқылы (DTPA) - аэробты ерітінділерде HS- автототығуының алдын алатын металл хелаторы (10-4 М). DTPA болмаған кезде HS- автототығу жылдамдығы 25°C температурада шамамен 3 сағат ішінде шамамен 50% құрайды37,47. Сонымен қатар, 1e-сульфидтің тотығуы ультракүлгін сәулемен катализденетіндіктен, ерітінді мұзда сақталып, жарықтан қорғалуы керек11.
5-суретте көрсетілгендей, NaHS суда еріген кезде Na+ және HS-6-ға диссоциацияланады; бұл диссоциация реакцияның pK1-імен анықталады, ол температураға тәуелді: pK1 = 3.122 + 1132/T, мұндағы T 5-тен 30°C-қа дейін және Кельвин (K) градусымен өлшенеді, K = °C + 273.1548. HS- жоғары pK2-ге ие (pK2 = 19), сондықтан рН < 96.49 кезінде S2- түзілмейді немесе өте аз мөлшерде түзіледі. Керісінше, HS- негіз ретінде әрекет етеді және H2O молекуласынан H+ қабылдайды, ал H2O қышқыл ретінде әрекет етеді және H2S және OH--ға айналады.
NaHS ерітіндісінде (30 мкМ) еріген H2S газының түзілуі. aq, сулы ерітінді; g, газ; l, сұйықтық. Барлық есептеулер судың рН = 7,0 және су температурасы = 20 °C деп есептейді. BioRender.com сайтында жасалған.
NaHS ерітінділерінің тұрақсыздығы туралы дәлелдерге қарамастан, бірнеше жануарларға жүргізілген зерттеулерде ауыз судағы NaHS ерітінділері H2S донорлық қосылысы ретінде қолданылды15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, араласу ұзақтығы 1-ден 21 аптаға дейін болды (2-кесте). Бұл зерттеулер барысында NaHS ерітіндісі әр 12 сағат сайын, 15, 17, 18, 24, 25 сағат немесе 24 сағат сайын, 19, 20, 21, 22, 23 сағат сайын жаңартылып отырды. Біздің нәтижелеріміз егеуқұйрықтардың NaHS ерітіндісінен H2S жоғалуына байланысты тұрақсыз дәрілік концентрацияларға ұшырағанын және егеуқұйрықтардың ауыз суындағы NaHS мөлшері 12 немесе 24 сағат ішінде айтарлықтай өзгергенін көрсетті (2-суретті қараңыз). Осы зерттеулердің екеуінде судағы H2S деңгейінің 24 сағат ішінде тұрақты болып қалғаны немесе 12 сағат ішінде H2S-тің тек 2-3% жоғалғаны байқалғаны туралы хабарланған, бірақ олар растайтын деректер немесе өлшеу мәліметтерін бермеген. Екі зерттеу су бөтелкелерінің диаметрінің кіші болуы H2S булануын азайта алатынын көрсетті15,19. Дегенмен, біздің нәтижелеріміз бұл су бөтелкесінен H2S жоғалуын 12-24 сағатқа емес, 2 сағатқа ғана кешіктіруі мүмкін екенін көрсетті. Екі зерттеу де ауыз судағы NaHS деңгейі өзгермеген деп болжайтынымызды атап өтеді, себебі біз суда түстің өзгеруін байқамадық; сондықтан H2S-тің ауамен тотығуы маңызды болған жоқ19,20. Таңқаларлықтай, бұл субъективті әдіс уақыт өте келе оның концентрациясының өзгеруін өлшеудің орнына судағы NaHS тұрақтылығын бағалайды.
NaHS ерітіндісіндегі H2S жоғалуы рН және температурамен байланысты. Біздің зерттеуімізде атап өтілгендей, NaHS суда еріген кезде сілтілі ерітінді түзіледі50. NaHS суда еріген кезде, еріген H2S газының түзілуі рН мәніне байланысты6. Ерітіндінің рН мәні неғұрлым төмен болса, H2S газ молекулалары ретіндегі NaHS үлесі соғұрлым көп болады және сулы ерітіндіден соғұрлым көп сульфид жоғалады11. Бұл зерттеулердің ешқайсысында NaHS үшін еріткіш ретінде пайдаланылатын ауыз судың рН мәні көрсетілмеген. Көптеген елдер қабылдаған ДДСҰ ұсыныстарына сәйкес, ауыз судың рН мәні 6,5–8,551 аралығында болуы керек. Бұл рН диапазонында H2S өздігінен тотығу жылдамдығы шамамен он есе артады13. NaHS суда осы рН диапазонында еріген кезде еріген H2S газының концентрациясы 1-ден 22,5 мкМ-ге дейін болады, бұл NaHS ерігенге дейін судың рН мәнін бақылаудың маңыздылығын көрсетеді. Сонымен қатар, жоғарыда аталған зерттеуде көрсетілген температура диапазоны (18–26 °C) ерітіндідегі еріген H2S газының концентрациясының шамамен 10%-ға өзгеруіне әкеледі, себебі температураның өзгеруі pK1-ді өзгертеді, ал pK1-дегі шағын өзгерістер еріген H2S газының концентрациясына айтарлықтай әсер етуі мүмкін48. Сонымен қатар, кейбір зерттеулердің ұзаққа созылуы (5 ай)22, оның барысында температураның үлкен өзгергіштігі күтіледі, бұл да бұл мәселені ушықтырады.
Бір зерттеуден басқа барлық зерттеулерде ауыз судағы 30 мкМ NaHS ерітіндісі қолданылды. Қолданылған дозаны (яғни 30 мкМ) түсіндіру үшін кейбір авторлар сулы фазадағы NaHS H2S газының дәл сол концентрациясын шығаратынын және H2S физиологиялық диапазоны 10-нан 100 мкМ-ге дейін екенін, сондықтан бұл доза физиологиялық диапазонда екенін атап өтті15,16. Басқалары 30 мкМ NaHS плазмадағы H2S деңгейін физиологиялық диапазонда, яғни 5–300 мкМ19,20 сақтай алатынын түсіндірді. Біз кейбір зерттеулерде H2S әсерін зерттеу үшін қолданылған 30 мкМ (рН = 7,0, Т = 20 °C) судағы NaHS концентрациясын қарастырамыз. Еріген H2S газының концентрациясы 14,7 мкМ екенін есептей аламыз, бұл бастапқы NaHS концентрациясының шамамен 50%-ын құрайды. Бұл мән басқа авторлар дәл осындай жағдайларда есептеген мәнге ұқсас13,48.
Біздің зерттеуімізде NaHS енгізу дене салмағын өзгерткен жоқ; бұл нәтиже еркек тышқандардағы басқа зерттеулердің нәтижелерімен сәйкес келеді22,23 және еркек егеуқұйрықтардағы18; Дегенмен, екі зерттеуде NaSH нефрэктомияланған егеуқұйрықтарда дене салмағының төмендеуін қалпына келтіргені туралы хабарланды24,26, ал басқа зерттеулерде NaSH енгізудің дене салмағына әсері туралы хабарланбаған15,16,17,19,20,21,25. Сонымен қатар, біздің зерттеуімізде NaSH енгізу сарысудағы мочевина мен креатин хром деңгейіне әсер еткен жоқ, бұл басқа есептің нәтижелерімен сәйкес келеді25.
Зерттеу нәтижесінде ауыз суға NaHS қосу еркек және аналық егеуқұйрықтардың сарысудағы сульфидтің жалпы концентрациясына әсер етпегені анықталды. Бұл тұжырым Сен және т.б. (16) нәтижелерімен сәйкес келеді: ауыз суда 30 мкМ NaHS-пен 8 апта емдеу бақылау егеуқұйрықтарында плазмадағы сульфид деңгейіне әсер етпеді; дегенмен, олар бұл араласу нефрэктомияланған тышқандардың плазмасындағы H2S деңгейінің төмендеуін қалпына келтіргенін хабарлады. Ли және т.б. (22) сонымен қатар ауыз суда 30 мкМ NaHS-пен 5 ай бойы емдеу егде жастағы тышқандарда плазмадағы бос сульфид деңгейін шамамен 26%-ға арттырғанын хабарлады. Басқа зерттеулерде ауыз суға NaHS қосқаннан кейін айналымдағы сульфидтің өзгеруі туралы хабарланбаған.
Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 әдісін қолдану арқылы жеті зерттеу жүргізілді, бірақ гидратация суы туралы қосымша мәліметтер берілмеді, ал бес зерттеуде оларды дайындау әдістерінде қолданылатын NaHS көзі айтылмады17,18,24,25,26. NaHS - гидратталған молекула және оның гидратациялық суының мөлшері әртүрлі болуы мүмкін, бұл берілген молярлық ерітіндіні дайындау үшін қажетті NaHS мөлшеріне әсер етеді. Мысалы, біздің зерттеуіміздегі NaHS мөлшері NaHS•1.3 H2O болды. Осылайша, бұл зерттеулердегі нақты NaHS концентрациясы хабарланғандардан төмен болуы мүмкін.
«Мұндай қысқа мерзімді қосылыстың қалайша ұзақ уақытқа созылатын әсері болуы мүмкін?» Позгай және т.б.21 тышқандардағы колитке NaHS әсерін бағалау кезінде осы сұрақты қойды. Олар болашақ зерттеулер бұл сұраққа жауап бере алады және NaHS ерітінділерінде H2S-тен басқа тұрақты полисульфидтер мен NaHS21 әсерін реттейтін дисульфидтер болуы мүмкін деген болжам жасайды деп үміттенеді. Тағы бір мүмкіндік - ерітіндіде қалған NaHS-тің өте төмен концентрациясы да пайдалы әсер етуі мүмкін. Шын мәнінде, Олсон және т.б. қандағы H2S микромолярлық деңгейлерінің физиологиялық емес екенін және наномолярлық диапазонда болуы немесе мүлдем болмауы керек екенін дәлелдеді13. H2S көптеген ақуыздардың қызметіне, тұрақтылығына және локализациясына әсер ететін қайтымды посттрансляциялық модификация ақуыз сульфациясы арқылы әрекет етуі мүмкін52,53,54. Шын мәнінде, физиологиялық жағдайларда көптеген бауыр ақуыздарының шамамен 10%-дан 25%-ға дейіні сульфталған53. Екі зерттеу де NaHS-тің тез жойылуын мойындайды19,23, бірақ таңқаларлықтай «біз күнделікті ауыстыру арқылы ауыз судағы NaHS концентрациясын бақыладық» деп мәлімдейді.23 Бір зерттеуде кездейсоқ «NaHS стандартты H2S доноры болып табылады және клиникалық тәжірибеде H2S-тің өзін ауыстыру үшін жиі қолданылады» деп айтылған.18
Жоғарыдағы талқылау NaHS ерітіндіден булану, тотығу және фотолиз арқылы жоғалатынын көрсетеді, сондықтан ерітіндіден H2S жоғалуын азайту бойынша кейбір ұсыныстар жасалады. Біріншіден, H2S булануы газ-сұйықтық интерфейсіне13 және ерітіндінің11 рН мәніне байланысты; сондықтан булану шығынын азайту үшін су бөтелкесінің мойнын бұрын сипатталғандай15,19 мүмкіндігінше кішірек етуге болады, ал булану шығынын азайту үшін судың рН мәнін қолайлы жоғарғы шекке дейін (яғни 6,5–8,551) реттеуге болады11. Екіншіден, H2S өздігінен тотығуы оттегінің әсерінен және ауыз суда өтпелі металл иондарының болуынан13 болады, сондықтан ауыз суды аргонмен немесе азотпен44,45 деоксигенизациялау және металл хелаторларын37,47 қолдану сульфидтердің тотығуын азайтуы мүмкін. Үшіншіден, H2S фотоыдырауының алдын алу үшін су бөтелкелерін алюминий фольгамен орауға болады; Бұл тәжірибе стрептозотоцин сияқты жарыққа сезімтал материалдарға да қатысты55. Соңында, бейорганикалық сульфид тұздарын (NaHS, Na2S және CaS) бұрын хабарланғандай ауыз суда ерітудің орнына зонд арқылы енгізуге болады56,57,58; зерттеулер егеуқұйрықтарға зонд арқылы енгізілген радиоактивті натрий сульфиді жақсы сіңетінін және барлық дерлік тіндерге таралатынын көрсетті59. Бүгінгі күнге дейін көптеген зерттеулер бейорганикалық сульфид тұздарын іш қуысына енгізді; дегенмен, бұл жол клиникалық жағдайларда сирек қолданылады60. Екінші жағынан, ауыз арқылы енгізу жолы - адамдарда ең көп таралған және артықшылықты енгізу жолы61. Сондықтан, кеміргіштерге H2S донорларының әсерін ауыз арқылы зонд арқылы бағалауды ұсынамыз.
Шектеу - біз сулы ерітіндідегі және сарысудағы сульфидті MB әдісін қолдана отырып өлшедік. Сульфидті өлшеу әдістеріне йод титрлеу, спектрофотометрия, электрохимиялық әдіс (потенциометрия, амперометрия, кулонометриялық әдіс және амперометриялық әдіс) және хроматография (газ хроматографиясы және жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясы) жатады, олардың ішінде ең көп қолданылатын әдіс - MB спектрофотометриялық әдісі62. Биологиялық үлгілердегі H2S өлшеуге арналған MB әдісінің шектеуі - ол барлық күкірт құрамдас қосылыстарды өлшейді, ал бос H2S63 емес, себебі ол қышқылдық жағдайда орындалады, бұл биологиялық көзден күкірттің бөлінуіне әкеледі64. Дегенмен, Америка қоғамдық денсаулық сақтау қауымдастығының мәліметтері бойынша, MB судағы сульфидті өлшеудің стандартты әдісі болып табылады65. Сондықтан, бұл шектеу NaHS бар ерітінділердің тұрақсыздығы бойынша біздің негізгі нәтижелерімізге әсер етпейді. Сонымен қатар, біздің зерттеуімізде NaHS бар судағы және сарысудағы үлгілердегі сульфидті өлшеулердің қалпына келуі сәйкесінше 91% және 93% болды. Бұл мәндер бұрын хабарланған диапазондарға (77–92)66 сәйкес келеді, бұл аналитикалық дәлдіктің қолайлы екенін көрсетеді42. Айта кету керек, біз клиникаға дейінгі зерттеулерде тек еркектерге арналған жануарларға жүргізілген зерттеулерге шамадан тыс тәуелділіктен аулақ болу үшін67 және мүмкіндігінше еркек және аналық егеуқұйрықтарды қамту үшін Ұлттық денсаулық сақтау институттарының (NIH) нұсқауларына сәйкес еркек және аналық егеуқұйрықтарды пайдаландық68. Бұл мәселені басқалар да атап өтті69,70,71.
Қорытындылай келе, осы зерттеудің нәтижелері ауыз судан дайындалған NaHS ерітінділерін тұрақсыздығына байланысты H2S өндіру үшін пайдалануға болмайтынын көрсетеді. Бұл енгізу жолы жануарларды тұрақсыз және күтілгеннен төмен NaHS деңгейіне ұшыратады; сондықтан бұл нәтижелер адамдарға қолданылмауы мүмкін.
Ағымдағы зерттеу барысында пайдаланылған және/немесе талданған деректер жиынтығы тиісті автордан ақылға қонымды сұраныс бойынша қолжетімді.
Сабо, К. Күкіртсутекті (H2S) зерттеудің хронологиясы: қоршаған орта токсинінен биологиялық медиаторға дейін. Биохимия және фармакология 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Абе, К. және Кимура, Х. Күкіртсутектің эндогендік нейромодулятор ретіндегі ықтимал рөлі. Неврология журналы, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Чирино, Г., Сабо, К. және Папапетропулос, А. Сүтқоректілер жасушаларындағы, тіндеріндегі және мүшелеріндегі күкіртсутектің физиологиялық рөлі. Физиология және молекулалық биологияға шолулар 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Диллон, К.М., Карраззон, Р.Дж., Матсон, Дж.Б. және Кашфи, К. Азот оксиді мен күкіртсутегін жасушалық жеткізу жүйелерінің дамып келе жатқан перспективасы: жекелендірілген медицинаның жаңа дәуірі. Биохимия және фармакология 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. және т.б. Баяу босатылатын күкіртсутек донорын ұзақ уақыт бойы енгізу миокард ишемиясының/реперфузия жарақатының алдын алады. Ғылыми есептер 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Ситдикова, Г.Ф., Фукс, Р., Кайнц, В., Вайгер, Т.М. және Герман, А. Б.К. арнасының фосфорлануы күкіртсутектің (H2S) сезімталдығын реттейді. Физиологиядағы шекаралар 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Ситдикова, Г.Ф., Вайгер, Т.М. және Герман, А. Күкіртсутегі егеуқұйрық гипофизінің ісік жасушаларында кальциймен белсендірілген калий (BK) өзекшесінің белсенділігін арттырады. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Джедди, С. және т.б. Күкіртсутегі 2 типті қант диабетімен ауыратын егеуқұйрықтарда миокард ишемиясы-реперфузия жарақатына қарсы нитриттің қорғаныс әсерін күшейтеді. Азот оксиді 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Корвино, А. және т.б. H2S донорлық химиясындағы үрдістер және оның жүрек-қан тамырлары ауруларына әсері. Антиоксиданттар 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
ДеЛеон, Э.Р., Стой, Г.Ф. және Олсон, К.Р. (2012). Биологиялық тәжірибелердегі күкіртсутектің пассивті жоғалуы. Аналитикалық биохимия 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Наги, П. және т.б. Физиологиялық үлгілердегі күкіртсутекті өлшеудің химиялық аспектілері. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Табиғи сулардағы күкіртсутегін спектрофотометриялық анықтау. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсон, К.Р. (2012). Күкіртсутектің химиясы мен биологиясы бойынша практикалық дайындық. «Антиоксиданттар». Тотығу-тотықсыздану сигнализациясы. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).