Біз бұрын бауыр фиброзы бар науқастарда ішектен алынған триптофан метаболиті индол-3-пропион қышқылының (ИҚҚ) сарысу деңгейінің төмен екенін хабарлаған болатынбыз. Бұл зерттеуде біз семіздікке шалдыққан бауырлардағы транскриптом мен ДНҚ метиломын сарысу ИҚҚ деңгейлерімен байланыстырдық, сондай-ақ ИҚҚ-ның бауыр жұлдызша жасушаларының (БЖЖ) in vitro фенотиптік инактивациясын индукциялаудағы рөлін зерттедік.
Зерттеуге Куопио бариатриялық хирургия орталығында (KOBS) бариатриялық хирургия жасалған 2 типті қант диабеті (2 типті қант диабеті) жоқ 116 семіздікке шалдыққан науқас (жасы 46,8 ± 9,3 жас; дене салмағының индексі: 42,7 ± 5,0 кг/м²) қатысты. Айналымдағы IPA деңгейлері сұйық хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) арқылы өлшенді, бауыр транскриптомының талдауы жалпы РНҚ секвенирлеу арқылы жүргізілді, ал ДНҚ метилденуінің талдауы Infinium HumanMethylation450 BeadChip көмегімен жүргізілді. In vitro тәжірибелер үшін адамның бауыр жұлдызша жасушалары (LX-2) пайдаланылды.
Сарысудағы IPA деңгейлері бауырдағы апоптоздық, митофагиялық және ұзақ өмір сүру жолдарына қатысатын гендердің экспрессиясымен өзара байланысты болды. AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) гені бауыр транскриптінде және ДНҚ метилдену профильдерінде ең көп таралған және басым өзара әрекеттесетін ген болды. IPA емі апоптозды тудырды, митохондриялық тыныс алуды төмендетті және LX-2 жасушаларының фиброзын, апоптозын және тіршілік етуін реттейтіні белгілі гендердің экспрессиясын модуляциялау арқылы жасуша морфологиясы мен митохондриялық динамикасын өзгертті.
Жалпы алғанда, бұл деректер IPA-ның әлеуетті терапиялық әсерлері бар екенін және апоптозды тудыруы және HSC фенотипін белсенді емес күйге ауыстыруы мүмкін екенін, осылайша HSC белсенділігіне және митохондриялық метаболизмге кедергі келтіру арқылы бауыр фиброзын тежеу ​​мүмкіндігін кеңейтетінін растайды.
Семіздік пен метаболикалық синдромның таралуы метаболикалық байланысты майлы бауыр ауруының (MASLD) көбеюімен байланысты болды; ауру жалпы халықтың 25%-дан 30%-ға дейін әсер етеді [1]. MASLD этиологиясының негізгі салдары - бауыр фиброзы, талшықты жасушадан тыс матрицаның (ECM) үздіксіз жиналуымен сипатталатын динамикалық процесс [2]. Бауыр фиброзына қатысатын негізгі жасушалар - бауыр жұлдызша жасушалары (HSCs), олар төрт белгілі фенотипті көрсетеді: тыныш, белсендірілген, белсенді емес және қартайған [3, 4]. HSCs белсендіріліп, тыныш түрінен жоғары энергияны қажет ететін пролиферативті фибробласт тәрізді жасушаларға трансдифференциалдануы мүмкін, α-тегіс бұлшықет актинінің (α-SMA) және I типті коллагеннің (Col-I) экспрессиясының жоғарылауымен [5, 6]. Бауыр фиброзының қалпына келуі кезінде белсендірілген HSCs апоптоз немесе инактивация арқылы жойылады. Бұл процестерге фиброгендік гендердің төмендеуі және протирвивальды гендердің модуляциясы (мысалы, NF-κB және PI3K/Akt сигнал беру жолдары) [7, 8], сондай-ақ митохондриялық динамика мен функцияның өзгеруі [9] кіреді.
Ішектің құрамында түзілетін триптофан метаболиті индол-3-пропион қышқылының (IPA) сарысу деңгейінің MASLD [10-13] қоса алғанда, адам метаболикалық ауруларында төмендегені анықталды. IPA тағамдық талшықтарды қабылдаумен байланысты, антиоксидантты және қабынуға қарсы әсерімен танымал және диетадан туындаған алкогольсіз стеатогепатит (NASH) фенотипін in vivo және in vitro жағдайында әлсіретеді [11-14]. Біздің алдыңғы зерттеуімізден кейбір дәлелдер алынған, олар Куопио бариатриялық хирургиялық зерттеуінде (KOBS) бауыр фиброзы бар науқастарда сарысу IPA деңгейінің бауыр фиброзы жоқ семіздікке шалдыққан науқастарға қарағанда төмен екенін көрсетті. Сонымен қатар, біз IPA емі адамның бауыр жұлдызша жасушасында (LX-2) жасуша адгезиясының, жасуша миграциясының және гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың белсенділігінің классикалық маркерлері болып табылатын және гепатопротекторлық метаболит болып табылатын гендердің экспрессиясын төмендетуі мүмкін екенін көрсеттік [15]. Дегенмен, IPA HSC апоптозын және митохондриялық биоэнергетиканы белсендіру арқылы бауыр фиброзының регрессиясын қалай индукциялайтыны әлі күнге дейін түсініксіз.
Мұнда біз сарысулық IPA семіздікке шалдыққан, бірақ 2 типті қант диабетімен (KOBS) ауырмайтын адамдардың бауырындағы апоптоз, митофагия және ұзақ өмір сүру жолдарына бай гендердің экспрессиясымен байланысты екенін көрсетеміз. Сонымен қатар, біз IPA инактивация жолы арқылы белсендірілген гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың (HSCs) тазартылуын және ыдырауын тудыруы мүмкін екенін анықтадық. Бұл нәтижелер IPA үшін жаңа рөлді ашады, бұл оны бауыр фиброзының регрессиясын ілгерілету үшін әлеуетті терапиялық нысанаға айналдырады.
KOBS когортасындағы алдыңғы зерттеу бауыр фиброзы бар науқастарда бауыр фиброзы жоқ науқастармен салыстырғанда айналымдағы IPA деңгейінің төмен екенін көрсетті [15]. 2 типті қант диабетінің ықтимал шатастырушы әсерін жоққа шығару үшін біз KOBS зерттеуінен 2 типті қант диабеті жоқ 116 семіздікке шалдыққан науқасты (орташа жасы ± SD: 46,8 ± 9,3 жас; BMI: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (1-кесте) зерттеу популяциясы ретінде тарттық [16]. Барлық қатысушылар жазбаша түрде келісім берді және зерттеу хаттамасы Хельсинки декларациясына (54/2005, 104/2008 және 27/2010) сәйкес Солтүстік Саво округінің ауруханасының этика комитетімен бекітілді.
Бауыр биопсиясының үлгілері бариатриялық хирургия кезінде алынды және тәжірибелі патологоанатомдар бұрын сипатталған критерийлерге сәйкес гистологиялық тұрғыдан бағалады [17, 18]. Бағалау критерийлері S1 қосымша кестесінде жинақталған және бұрын сипатталған [19].
Аш қарынға арналған сарысу үлгілері метаболомиканы талдау үшін мақсатты емес сұйық хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) арқылы талданды (n = 116). Үлгілер бұрын сипатталғандай UHPLC-qTOF-MS жүйесін (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Германия) пайдаланып талданды19. Изопропил спиртін (IPA) анықтау сақтау уақытына және MS/MS спектрін таза стандарттармен салыстыруға негізделген. IPA сигналының қарқындылығы (шың аймағы) барлық кейінгі талдауларда ескерілді [20].
Бауырдың тұтас РНҚ секвенирлеуі Illumina HiSeq 2500 көмегімен жүргізілді және деректер бұрын сипатталғандай алдын ала өңделді [19, 21, 22]. Біз MitoMiner 4.0 дерекқорынан таңдалған 1957 генді пайдаланып, митохондриялық функцияға/биогенезге әсер ететін транскрипттердің мақсатты дифференциалды экспрессиялық талдауын жүргіздік [23]. Бауыр ДНҚ метилденуін талдау бұрын сипатталған әдістемені қолдана отырып, Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, АҚШ) көмегімен жүргізілді [24, 25].
Адам бауырының жұлдызша тәрізді жасушаларын (LX-2) профессор Стефано Ромео ұсынды және олар DMEM/F12 ортасында (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) өсіріліп, сақталды. IPA жұмыс дозасын таңдау үшін LX-2 жасушалары DMEM/F12 ортасында 24 сағат бойы әртүрлі концентрациядағы IPA-мен (10 мкМ, 100 мкМ және 1 мМ; Sigma, 220027) өңделді. Сонымен қатар, IPA-ның HSC-лерді инактивтеу қабілетін зерттеу үшін LX-2 жасушалары сарысусыз ортада 24 сағат бойы 5 нг/мл TGF-β1 (R&D жүйелері, 240-B-002/CF) және 1 мМ IPA-мен бірге өңделді. Тиісті көлік құралдарын басқару үшін TGF-β1 емі үшін 0,1% BSA бар 4 нМ HCL және IPA емі үшін 0,05% DMSO пайдаланылды, және екеуі де біріктірілген ем үшін бірге қолданылды.
Апоптоз өндірушінің нұсқауларына сәйкес FITC Annexin V апоптозды анықтау жинағын 7-AAD (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, АҚШ, Cat# 640922) пайдаланып бағаланды. Қысқаша айтқанда, LX-2 (1 × 105 жасуша/ұяшық) 12 ұңғымалы пластиналарда түні бойы өсірілді, содан кейін IPA немесе IPA және TGF-β1 бірнеше дозасымен өңделді. Келесі күні қалқымалы және адгезияланған жасушалар жиналды, трипсинделді, PBS-пен жуылды, Annexin V байланыстырушы буферінде қайта суспензияланды және FITC-Annexin V және 7-AAD-пен 15 минут бойы инкубацияланды.
Тірі жасушалардағы митохондриялар тотығу белсенділігіне Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) көмегімен боялды. MTR талдаулары үшін LX-2 жасушалары IPA және TGF-β1-мен бірдей тығыздықта инкубацияланды. 24 сағаттан кейін тірі жасушалар трипсинделді, PBS-пен жуылды, содан кейін бұрын сипатталғандай [26] 37°C температурада 20 минут бойы сарысусыз ортада 100 мкМ MTR-мен инкубацияланды. Тірі жасуша морфологиясын талдау үшін жасуша өлшемі мен цитоплазмалық күрделілігі сәйкесінше алға шашыраңқылық (FSC) және бүйірлік шашыраңқылық (SSC) параметрлерін пайдаланып талданды.
Барлық деректер (30 000 оқиға) NovoCyte Quanteon (Agilent) көмегімен жиналды және NovoExpress® 1.4.1 немесе FlowJo V.10 бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып талданды.
Оттегі тұтыну жылдамдығы (OCR) және жасушадан тыс қышқылдану жылдамдығы (ECAR) өндірушінің нұсқауларына сәйкес Seahorse XF Cell Mito Stress жабдықталған Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) көмегімен нақты уақыт режимінде өлшенді. Қысқаша айтқанда, 2 × 104 LX-2 жасушалары/ұяшық XF96 жасуша дақылының пластиналарына себілді. Түнгі инкубациядан кейін жасушалар изопропанолмен (IPA) және TGF-β1-мен өңделді (қосымша әдістер 1). Деректерді талдау Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator қамтитын Seahorse XF Wave бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып жүргізілді. Осыдан биоэнергетикалық денсаулық индексі (BHI) есептелді [27].
Жалпы РНҚ кДНҚ-ға транскрипцияланды. Нақты әдістер үшін [15] сілтемесін қараңыз. Адамның 60S рибосомалық қышқылды ақуызы P0 (RPLP0) және циклофилин A1 (PPIA) мРНҚ деңгейлері конститутивті гендік бақылау ретінде пайдаланылды. QuantStudio 6 pro Real-Time ПТР жүйесі (Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерланды) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) немесе Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) көмегімен пайдаланылды, ал геннің салыстырмалы экспрессиясының қатпарлануы салыстырмалы Ct мәнінің циклдік параметрлерін (ΔΔCt) және ∆∆Ct әдісін қолдана отырып есептелді. Праймерлердің егжей-тегжейлері S2 және S3 қосымша кестелерінде келтірілген.
Ядролық ДНҚ (ncDNA) және митохондриялық ДНҚ (mtDNA) бұрын сипатталғандай [28] DNeasy қан және тін жинағын (Qiagen) пайдаланып алынды. mtDNA салыстырмалы мөлшері әрбір нысаналы mtDNA аймағының үш ядролық ДНҚ аймағының (mtDNA/ncDNA) геометриялық орташа мәніне қатынасын есептеу арқылы есептелді, бұл туралы 2-қосымша әдістерде егжей-тегжейлі сипатталған. mtDNA және ncDNA праймерлерінің егжей-тегжейлері S4 қосымша кестесінде келтірілген.
Тірі жасушалар жасушааралық және жасушаішілік митохондриялық желілерді визуализациялау үшін Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) құрылғысымен боялды. LX-2 жасушалары (1 × 104 жасуша/ұяшық) шыны слайдтарда сәйкес шыны түбі бар дақыл пластиналарында (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Германия) өсірілді. 24 сағаттан кейін тірі LX-2 жасушалары 37 °C температурада 20 минут бойы 100 мкМ MTR-мен инкубацияланды, ал жасуша ядролары бұрын сипатталғандай DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich) құрылғысымен боялды [29]. Митохондриялық желілер 37 °C температурада 5% CO2 бар ылғалдандырылған атмосферада 63 × NA 1.3 объективін пайдаланып, Zeiss LSM 800 конфокальды модулімен жабдықталған Zeiss Axio Observer инверттелген микроскопымен (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) көрнекіленді. Әрбір үлгі түрі үшін біз он Z сериялы кескін алдық. Әрбір Z сериясы әрқайсысының қалыңдығы 9,86 мкм болатын 30 бөлімнен тұрады. Әрбір үлгі үшін ZEN 2009 бағдарламалық жасақтамасын (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) пайдаланып он түрлі көру өрісінің кескіндері алынды, ал митохондриялық морфологияны талдау ImageJ бағдарламалық жасақтамасын (v1.54d) [30, 31] пайдаланып, 3-қосымша әдістерде егжей-тегжейлі сипатталған параметрлерге сәйкес жүргізілді.
Жасушалар 0,1 М фосфат буферінде 2% глутаральдегидпен бекітілді, содан кейін 1% осмий тетроксиді ерітіндісімен бекітілді (Sigma Aldrich, MO, АҚШ), ацетонмен біртіндеп кептірілді (Merck, Дармштадт, Германия) және соңында эпоксидті шайырға енгізілді. Ультра жұқа кесінділер дайындалып, 1% уранил ацетатымен (Merck, Дармштадт, Германия) және 1% қорғасын цитратымен (Merck, Дармштадт, Германия) боялды. Ультрақұрылымдық кескіндер 80 кВ үдемелі кернеуде JEM 2100F EXII беріліс электронды микроскопын (JEOL Ltd, Токио, Жапония) пайдаланып алынды.
24 сағат бойы IPA-мен өңделген LX-2 жасушаларының морфологиясы Zeiss инверттелген жарық микроскопын (Zeiss Axio Vert.A1 және AxioCam MRm, Йена, Германия) пайдаланып, 50 есе үлкейту кезінде фазалық-контрастты микроскопия арқылы талданды.
Клиникалық деректер орташа ± стандартты ауытқу немесе медиана (квартиль аралық диапазон: IQR) ретінде көрсетілді. Үш зерттеу тобы арасындағы айырмашылықтарды салыстыру үшін дисперсияның бір жақты талдауы (үздіксіз айнымалылар) немесе χ² сынағы (категориялық айнымалылар) пайдаланылды. Бірнеше тестілеуді түзету үшін жалған оң көрсеткіш (FDR) пайдаланылды, ал FDR < 0,05 гендер статистикалық тұрғыдан маңызды деп саналды. CpG ДНҚ метилденуін IPA сигналының қарқындылығымен корреляциялау үшін Спирмен корреляциялық талдауы қолданылды, номиналды p мәндері (p < 0,05) хабарланды.
Жол талдауы 268 транскрипт (номиналды p < 0,01), 119 митохондриямен байланысты транскрипт (номиналды p < 0,05) және қан сарысуындағы IPA деңгейлерімен байланысты 3093 бауыр транскриптінің 4350 CpG үшін веб-негізделген ген жиынтығын талдау құралын (WebGestalt) пайдаланып жүргізілді. Еркін қолжетімді Venny DB (2.1.0 нұсқасы) құралы қабаттасатын гендерді табу үшін, ал StringDB (11.5 нұсқасы) ақуыз-ақуыз өзара әрекеттесуін визуализациялау үшін пайдаланылды.
LX-2 эксперименті үшін үлгілер D'Agostino-Pearson сынағын пайдаланып қалыптылыққа тексерілді. Деректер кем дегенде үш биологиялық қайталаудан алынды және Bonferroni post hoc сынағымен бір жақты ANOVA-ға ұшырады. 0,05-тен аз p-мәні статистикалық тұрғыдан маңызды деп саналды. Деректер орташа ± SD ретінде көрсетілген және әрбір суретте эксперименттер саны көрсетілген. Барлық талдаулар мен графиктер Windows үшін GraphPad Prism 8 статистикалық бағдарламалық жасақтамасын (GraphPad Software Inc., 8.4.3 нұсқасы, Сан-Диего, АҚШ) пайдаланып жүргізілді.
Алдымен, біз сарысудағы IPA деңгейлерінің бауырмен, бүкіл денемен және митохондриялық транскрипттермен байланысын зерттедік. Жалпы транскрипт профилінде сарысудағы IPA деңгейлерімен байланысты ең күшті ген MAPKAPK3 болды (FDR = 0,0077; митогенмен белсендірілген ақуыз киназасымен белсендірілген ақуыз киназа 3); митохондриямен байланысты транскрипт профилінде ең күшті байланысты ген AKT1 болды (FDR = 0,7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Қосымша файл 1 және Қосымша файл 2).
Содан кейін біз жаһандық транскрипттерді (n = 268; p < 0,01) және митохондриямен байланысты транскрипттерді (n = 119; p < 0,05) талдадық, сайып келгенде, апоптозды ең маңызды канондық жол ретінде анықтадық (p = 0,0089). Сарысудағы IPA деңгейлерімен байланысты митохондриялық транскрипттер үшін біз апоптозға (FDR = 0,00001), митофагияға (FDR = 0,00029) және TNF сигнал беру жолдарына (FDR = 0,000006) назар аудардық (1A сурет, 2-кесте және 1A-B қосымша суреттер).
Адам бауырындағы жаһандық, митохондриямен байланысты транскрипттердің және ДНҚ метилденуінің сарысу IPA деңгейлерімен байланысты қабаттасатын талдауы. A сарысу IPA деңгейлерімен байланысты 3092 CpG учаскелеріне картаға түсірілген 268 жаһандық транскриптті, 119 митохондриямен байланысты транскриптті және ДНҚ метилденген транскрипттерді білдіреді (жаһандық транскрипттер мен ДНҚ метилденген үшін p мәндері < 0,01, ал митохондриялық транскрипттер үшін p мәндері < 0,05). Негізгі қабаттасатын транскрипттер ортада көрсетілген (AKT1 және YKT6). B Ең жоғары өзара әрекеттесу ұпайы (0,900) бар 13 геннің басқа гендермен өзара әрекеттесу картасы StringDB онлайн құралын пайдаланып сарысу IPA деңгейлерімен айтарлықтай байланысты 56 қабаттасатын гендерден (қара сызық аймағы) құрастырылды. Жасыл: Ген онтологиясы (GO) жасушалық компонентіне картаға түсірілген гендер: митохондриялар (GO:0005739). AKT1 - деректерге негізделген (мәтіндік іздеу, эксперименттер, дерекқорлар және бірлескен экспрессия негізінде) басқа ақуыздармен әрекеттесу бойынша ең жоғары баллға (0,900) ие ақуыз. Желілік түйіндер ақуыздарды, ал жиектер ақуыздар арасындағы байланыстарды білдіреді.
Ішек микробиотасы метаболиттері ДНҚ метилденуі арқылы эпигенетикалық құрамды реттей алатындықтан [32], біз сарысудағы IPA деңгейлерінің бауыр ДНҚ метилденуімен байланысты екенін зерттедік. Біз сарысудағы IPA деңгейлерімен байланысты екі негізгі метилдену орны пролинге бай 3-аймаққа (C19orf55) және жылу соққысы ақуызының B (кіші) тұқымдасының 6-мүшесіне (HSPB6) жақын екенін анықтадық (қосымша файл 3). 4350 CpG ДНҚ метилденуі (p < 0,01) сарысудағы IPA деңгейлерімен корреляцияланған және ұзақ өмір сүруді реттеу жолдарымен байытылған (p = 0,006) (1A сурет, 2-кесте және қосымша 1C сурет).
Адам бауырындағы сарысу IPA деңгейлері, жаһандық транскрипттер, митохондриямен байланысты транскрипттер және ДНҚ метилденуі арасындағы байланыстың негізінде жатқан биологиялық механизмдерді түсіну үшін біз алдыңғы жол талдауында анықталған гендердің қабаттасу талдауын жүргіздік (1A сурет). 56 қабаттасқан геннің жолды байыту талдауының нәтижелері (1A суреттегі қара сызықтың ішінде) апоптоз жолының (p = 0,00029) үш талдауға ортақ екі генді бөліп көрсеткенін көрсетті: Венн диаграммасында көрсетілгендей (қосымша 2-сурет және 1A сурет). Қызығы, біз AKT1 (cg19831386) және YKT6 (cg24161647) сарысу IPA деңгейлерімен оң корреляцияланғанын анықтадық (қосымша 3-файл). Ген өнімдері арасындағы ықтимал ақуыз өзара әрекеттесулерін анықтау үшін біз кіріс ретінде 56 қабаттасқан гендердің арасынан ең жоғары ортақ аймақ ұпайы (0,900) бар 13 генді таңдадық және өзара әрекеттесу картасын құрдық. Сенiмдiлiк деңгейiне (шекті сенiмдiлiк) сәйкес, ең жоғары балл (0,900) алған AKT1 генi ең жоғары орында болды (1B сурет).
Жолды талдау негізінде біз апоптоздың негізгі жол екенін анықтадық, сондықтан IPA емінің HSC-лердің апоптозына in vitro әсер ететінін зерттедік. Біз бұған дейін IPA-ның әртүрлі дозаларының (10 мкМ, 100 мкМ және 1 мМ) LX-2 жасушалары үшін улы емес екенін көрсеттік [15]. Бұл зерттеу IPA емінің 10 мкМ және 100 мкМ концентрациясында тіршілікке қабілетті және некрозға ұшыраған жасушалар санын арттыратынын көрсетті. Дегенмен, бақылау тобымен салыстырғанда, жасуша тіршілікке қабілеттілігі 1 мМ IPA концентрациясында төмендеді, ал жасуша некрозының жылдамдығы өзгеріссіз қалды (2А, В суреттер). Әрі қарай, LX-2 жасушаларында апоптозды индукциялау үшін оңтайлы концентрацияны табу үшін біз 24 сағат бойы 10 мкМ, 100 мкМ және 1 мМ IPA сынағын өткіздік (2А-Е суреті және қосымша 3А-В суреті). Қызығы, IPA 10 μM және 100 μM апоптоз жылдамдығын (%) төмендетті, дегенмен, IPA 1 mM бақылау тобымен салыстырғанда кеш апоптоз бен апоптоз жылдамдығын (%) арттырды, сондықтан одан әрі эксперименттер үшін таңдалды (2A–D суреттері).
IPA LX-2 жасушаларының апоптозын индукциялайды. Апоптоз жылдамдығын және жасуша морфологиясын ағынды цитометрия арқылы сандық анықтау үшін аннексин V және 7-AAD қос бояу әдісі қолданылды. BA жасушалары 24 сағат бойы 10 мкМ, 100 мкМ және 1 мМ IPA-мен немесе F–H TGF-β1 (5 нг/мл) және 1 мМ IPA-мен сарысусыз ортада 24 сағат бойы инкубацияланды. A: тірі жасушалар (Annexin V -/ 7AAD-); B: некроздалған жасушалар (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: ерте (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: кеш (Annexin V+/7AAD.+); E, H: апоптоз жылдамдығындағы ерте және кеш апоптозды жасушалардың жалпы пайызы (%). Деректер орташа ± SD ретінде көрсетілген, n = 3 тәуелсіз эксперимент. Статистикалық салыстырулар бір жақты ANOVA және Bonferroni post hoc сынағы арқылы жүргізілді. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Бұрын көрсеткендей, 5 нг/мл TGF-β1 классикалық маркер гендерінің экспрессиясын арттыру арқылы HSC белсенділігін тудыруы мүмкін [15]. LX-2 жасушалары 5 нг/мл TGF-β1 және 1 мМ IPA-мен біріктірілген түрде өңделді (2E–H сурет). TGF-β1 емі апоптоз жылдамдығын өзгерткен жоқ, дегенмен, IPA-мен бірлескен емдеу TGF-β1 емімен салыстырғанда кеш апоптоз бен апоптоз жылдамдығын (%) арттырды (2E–H сурет). Бұл нәтижелер 1 мМ IPA TGF-β1 индукциясынан тәуелсіз LX-2 жасушаларында апоптозды ынталандыра алатынын көрсетеді.
Біз LX-2 жасушаларындағы митохондриялық тыныс алуға IPA әсерін одан әрі зерттедік. Нәтижелер 1 мМ IPA бақылау тобымен салыстырғанда оттегі тұтыну жылдамдығының (OCR) параметрлерін төмендеткенін көрсетті (3A, B сурет), ал биоэнергетикалық денсаулық индексі (BHI) өзгерген жоқ.
IPA LX-2 жасушаларында митохондриялық тыныс алуды төмендетеді. Митохондриялық тыныс алу қисығы (OCR) митохондриялық тыныс алу параметрлері (митохондриялық емес тыныс алу, базальды тыныс алу, максималды тыныс алу, протон ағып кетуі, АТФ генерациясы, SRC және BHI) ретінде ұсынылған. А және В жасушалары сәйкесінше 10 мкМ, 100 мкМ және 1 мМ IPA-мен 24 сағат бойы инкубацияланды. С және D жасушалары сарысусыз ортада TGF-β1 (5 нг/мл) және 1 мМ IPA-мен сәйкесінше 24 сағат бойы инкубацияланды. Барлық өлшемдер CyQuant жинағын пайдаланып ДНҚ құрамына сәйкестендірілді. BHI: биоэнергетикалық денсаулық индексі; SRC: тыныс алу резервтік сыйымдылығы; OCR: оттегі тұтыну жылдамдығы. Деректер орташа ± стандартты ауытқу (SD), n = 5 тәуелсіз эксперимент ретінде ұсынылған. Статистикалық салыстырулар бір жақты ANOVA және Bonferroni post hoc сынағы арқылы жүргізілді. *p < 0,05; **p < 0,01; және ***p < 0,001
IPA-ның TGF-β1-белсендірілген LX-2 жасушаларының биоэнергетикалық профиліне әсерін жан-жақты түсіну үшін біз OCR арқылы митохондриялық тотығу фосфорлануын талдадық (3C, D сурет). Нәтижелер TGF-β1 емі бақылау тобымен салыстырғанда максималды тыныс алуды, тыныс алу резервтік сыйымдылығын (SRC) және BHI төмендетуі мүмкін екенін көрсетті (3C, D сурет). Сонымен қатар, аралас емдеу базальды тыныс алуды, протонның ағуын және АТФ өндірісін төмендетті, бірақ SRC және BHI TGF-β1-мен өңделгендерге қарағанда айтарлықтай жоғары болды (3C, D сурет).
Біз сондай-ақ Seahorse бағдарламалық жасақтамасы ұсынған «Жасушалық энергия фенотипі сынағын» жүргіздік (4A–D қосымша сурет). 3B қосымша суретте көрсетілгендей, TGF-β1 емінен кейін OCR және ECAR метаболикалық потенциалдары төмендеді, дегенмен, бақылау тобымен салыстырғанда біріктірілген және IPA емдеу топтарында ешқандай айырмашылық байқалмады. Сонымен қатар, біріктірілген және IPA емдеуден кейін OCR базальды және стресс деңгейлері бақылау тобымен салыстырғанда төмендеді (4C қосымша сурет). Қызығы, ұқсас үлгі біріктірілген терапиямен де байқалды, мұнда TGF-β1 емінен салыстырғанда ECAR базальды және стресс деңгейлерінде ешқандай өзгеріс байқалмады (4C қосымша сурет). HSC-лерде митохондриялық тотығу фосфорлануының төмендеуі және біріктірілген емнің TGF-β1 еміне ұшырағаннан кейін SCR мен BHI қалпына келтіру мүмкіндігі метаболикалық потенциалды өзгертпеді (OCR және ECAR). Бұл нәтижелер IPA HSC-лердегі биоэнергетиканы төмендетуі мүмкін екенін көрсетеді, бұл IPA HSC фенотипін инактивацияға қарай жылжытатын төмен энергетикалық профильді тудыруы мүмкін екенін көрсетеді (қосымша 4D сурет).
IPA-ның митохондриялық динамикаға әсері митохондриялық морфология мен желілік қосылыстардың үш өлшемді сандық бағалауын, сондай-ақ MTR бояуын қолдану арқылы зерттелді (4-сурет және 5-қосымша сурет). 4-суретте бақылау тобымен салыстырғанда TGF-β1 емі орташа беттік ауданды, тармақ санын, жалпы тармақ ұзындығын және тармақ түйіспе санын азайтқаны (4A және B суреттері) және митохондриялықтардың үлесін сфералықтан аралық морфологияға өзгерткені көрсетілген (4C сурет). Тек IPA емі бақылау тобымен салыстырғанда митохондриялықтардың орташа көлемін азайтып, митохондриялықтардың үлесін сфералықтан аралық морфологияға өзгертті (4A суреті). Керісінше, митохондриялық мембраналық потенциалға тәуелді MTR арқылы бағаланған сфералық, орташа тармақ ұзындығы және митохондриялық белсенділік (4A және E суреттері) өзгеріссіз қалды және бұл параметрлер топтар арасында ерекшеленбеді. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер TGF-β1 және IPA емі тірі LX-2 жасушаларында митохондриялық пішін мен өлшемді, сондай-ақ желілік күрделілікті модуляциялайтын сияқты екенін көрсетеді.
IPA LX-2 жасушаларындағы митохондриялық динамиканы және митохондриялық ДНҚ молдығын өзгертеді. A. TGF-β1 (5 нг/мл) және 1 мМ IPA-мен 24 сағат бойы сарысусыз ортада инкубацияланған тірі LX-2 жасушаларының репрезентативті конфокальды кескіндері, олар Mitotracker™ Red CMXRos-пен боялған митохондриялық желілерді және DAPI-мен көк түске боялған ядроларды көрсетеді. Барлық деректерде топтан кемінде 15 кескін болды. Біз әрбір үлгі түрі үшін 10 Z-стек кескінін алдық. Әрбір Z осі тізбегінде әрқайсысының қалыңдығы 9,86 мкм болатын 30 кесінді болды. Масштаб жолағы: 10 мкм. B. Кескінге бейімделгіш шекті қолдану арқылы анықталған репрезентативті нысандар (тек митохондриялар). Әр топтағы барлық жасушалар үшін митохондриялық морфологиялық желілік байланыстарды сандық талдау және салыстыру жүргізілді. C. Митохондриялық пішін қатынастарының жиілігі. 0-ге жақын мәндер сфералық пішіндерді, ал 1-ге жақын мәндер жіп тәрізді пішіндерді көрсетеді. D Митохондриялық ДНҚ (мтДНҚ) құрамы «Материалдар мен әдістер» бөлімінде сипатталғандай анықталды. E Mitotracker™ Red CMXRos талдауы «Материалдар мен әдістер» бөлімінде сипатталғандай ағынды цитометрия арқылы (30 000 оқиға) жүргізілді. Деректер орташа ± SD, n = 3 тәуелсіз эксперимент ретінде ұсынылған. Статистикалық салыстырулар бір жақты ANOVA және Bonferroni post hoc сынағын қолдану арқылы жүргізілді. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Содан кейін біз LX-2 жасушаларындағы мтДНҚ мөлшерін митохондриялық санның индикаторы ретінде талдадық. Бақылау тобымен салыстырғанда, TGF-β1-мен емделген топта мтДНҚ мөлшері жоғарылады (4D сурет). TGF-β1-мен емделген топпен салыстырғанда, аралас емдеу тобында мтДНҚ мөлшері төмендеді (4D сурет), бұл IPA мтДНҚ мөлшерін және мүмкін митохондриялық санды, сондай-ақ митохондриялық тыныс алуды азайтуы мүмкін екенін көрсетеді (3C сурет). Сонымен қатар, IPA аралас емдеуде мтДНҚ мөлшерін төмендеткен сияқты, бірақ MTR арқылы жүзеге асырылатын митохондриялық белсенділікке әсер еткен жоқ (4A–C суреттер).
Біз IPA-ның LX-2 жасушаларындағы фиброзбен, апоптозбен, тіршілік етумен және митохондриялық динамикамен байланысты гендердің мРНҚ деңгейлерімен байланысын зерттедік (5A–D сурет). Бақылау тобымен салыстырғанда, TGF-β1-мен емделген топта I типті коллаген α2 тізбегі (COL1A2), α-тегіс бұлшықет актині (αSMA), матрицалық металлопротеиназа 2 (MMP2), металлопротеиназа 1 тінінің ингибиторы (TIMP1) және динамин 1-тәрізді ген (DRP1) сияқты гендердің экспрессиясының жоғарылауы байқалды, бұл фиброз бен белсенділіктің жоғарылауын көрсетеді. Сонымен қатар, бақылау тобымен салыстырғанда, TGF-β1-мен емдеу ядролық прегнан X рецепторының (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, В-жасуша α ингибиторы, ядролық фактор κ генінің жарық пептидін күшейткіш (NFκB1A) және ядролық фактор κB киназа суббірлігі β ингибиторының (IKBKB) мРНҚ деңгейін төмендетті (5A–D сурет). TGF-β1 емімен салыстырғанда, TGF-β1 және IPA-мен біріктірілген ем COL1A2 және MMP2 экспрессиясын төмендетті, бірақ PXR, TIMP1, B-жасушалық лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β және IKBKB мРНҚ деңгейін арттырды. IPA емі MMP2, Bcl-2-ассоциацияланған ақуыз X (BAX), AKT1, оптикалық атрофия ақуызы 1 (OPA1) және митохондриялық бірігу ақуызы 2 (MFN2) экспрессиясын айтарлықтай төмендетті, ал CASP8, NFκB1A, NFκB1B және IKBKB экспрессиясы бақылау тобымен салыстырғанда жоғарылады. Дегенмен, каспаза-3 (CASP3), апоптотикалық пептидазаны белсендіруші фактор 1 (APAF1), митохондриялық бірігу ақуызы 1 (MFN1) және бөліну ақуызы 1 (FIS1) экспрессиясында ешқандай айырмашылық табылған жоқ. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер IPA емінің фиброзбен, апоптозбен, тіршілік етумен және митохондриялық динамикамен байланысты гендердің экспрессиясын модуляциялайтынын көрсетеді. Біздің деректеріміз IPA емі LX-2 жасушаларындағы фиброзды төмендететінін көрсетеді; сонымен бірге фенотипті инактивацияға қарай жылжыту арқылы тіршілік етуді ынталандырады.
IPA LX-2 жасушаларындағы фибробласт, апоптоз, тіршілікке қабілеттілік және митохондриялық динамика гендерінің экспрессиясын модуляциялайды. Гистограммалар LX-2 жасушалары TGF-β1 және IPA-мен сарысусыз ортада 24 сағат бойы индукцияланғаннан кейін эндогендік бақылауға (RPLP0 немесе PPIA) қатысты мРНҚ экспрессиясын көрсетеді. A фибробласттарды, B апоптоздық жасушаларды, C тірі қалған жасушаларды және D митохондриялық динамика генінің экспрессиясын көрсетеді. Деректер орташа ± стандартты ауытқу (SD), n = 3 тәуелсіз эксперименттер ретінде ұсынылған. Статистикалық салыстырулар бір жақты ANOVA және Bonferroni post hoc сынағын қолдану арқылы жүргізілді. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Содан кейін жасуша өлшемінің (FSC-H) және цитоплазмалық күрделіліктің (SSC-H) өзгеруі ағынды цитометрия арқылы бағаланды (6A, B сурет), ал IPA емінен кейінгі жасуша морфологиясының өзгерістері трансмиссиялық электронды микроскопия (TEM) және фазалық контрастты микроскопия арқылы бағаланды (қосымша 6A-B сурет). Күтілгендей, TGF-β1-мен емделген топтағы жасушалар бақылау тобымен салыстырғанда мөлшері бойынша ұлғайды (6A, B сурет), бұл кедір-бұдыр эндоплазмалық тордың (ER*) және фаголизосомалардың (P) классикалық кеңеюін көрсетті, бұл гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың (HSC) белсендірілуін көрсетеді (қосымша 6A сурет). Дегенмен, TGF-β1-мен емделген топпен салыстырғанда, TGF-β1 және IPA біріктірілген емдеу тобында жасуша өлшемі, цитоплазмалық күрделілік (6A, B сурет) және ER* мөлшері төмендеді (қосымша 6A сурет). Сонымен қатар, IPA емдеуі бақылау тобымен салыстырғанда жасуша өлшемін, цитоплазмалық күрделілікті (6A, B суреттері), P және ER* мөлшерін (қосымша 6A суреті) азайтты. Сонымен қатар, апоптоздық жасушалардың мөлшері бақылау тобымен салыстырғанда IPA емдеуден кейін 24 сағаттан кейін артты (ақ көрсеткілер, қосымша 6B суреті). Жалпы алғанда, бұл нәтижелер 1 мМ IPA HSC апоптозын ынталандыра алатынын және TGF-β1 тудырған жасуша морфологиялық параметрлеріндегі өзгерістерді кері қайтара алатынын, осылайша HSC инактивациясымен байланысты болуы мүмкін жасуша өлшемі мен күрделілігін реттей алатынын көрсетеді.
IPA LX-2 жасушаларында жасуша өлшемін және цитоплазмалық күрделілікті өзгертеді. Ағынды цитометрия талдауының типтік суреттері. Талдау кезінде LX-2 жасушаларына тән қақпа стратегиясы қолданылды: жасуша популяциясын анықтау үшін SSC-A/FSC-A, дублеттерді анықтау үшін FSC-H/FSC-A және жасуша өлшемі мен күрделілігін талдау үшін SSC-H/FSC-H. Жасушалар TGF-β1 (5 нг/мл) және 1 мМ IPA-мен сарысусыз ортада 24 сағат бойы инкубацияланды. LX-2 жасушалары жасуша өлшемі мен цитоплазмалық күрделілігін талдау үшін төменгі сол жақ квадрантқа (SSC-H-/FSC-H-), жоғарғы сол жақ квадрантқа (SSC-H+/FSC-H-), төменгі оң жақ квадрантқа (SSC-H-/FSC-H+) және жоғарғы оң жақ квадрантқа (SSC-H+/FSC-H+) бөлінді. B. Жасуша морфологиясы FSC-H (алға шашыраңқылық, жасуша өлшемі) және SSC-H (бүйірлік шашыраңқылық, цитоплазмалық күрделілік) (30 000 оқиға) көмегімен ағынды цитометрия арқылы талданды. Деректер орташа ± SD, n = 3 тәуелсіз эксперимент ретінде ұсынылған. Статистикалық салыстырулар бір жақты ANOVA және Bonferroni post hoc сынағын қолдану арқылы жүргізілді. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 және ****p < 0,0001
IPA сияқты ішек метаболиттері зерттеудің өзекті тақырыбына айналды, бұл ішек микробиотасында жаңа нысаналардың табылуы мүмкін екенін көрсетеді. Сондықтан, адамдардағы бауыр фиброзы [15]мен байланыстырған метаболит IPA жануарлар модельдерінде фиброзға қарсы әлеуетті қосылыс екені көрсетілгені қызықты [13, 14]. Мұнда біз алғаш рет 2 типті қант диабеті (T2D) жоқ семіздікке шалдыққан адамдарда сарысу IPA мен бауырдың жаһандық транскриптомикасы мен ДНҚ метилденуі арасындағы байланысты көрсетеміз, апоптозды, митофагияны және ұзақ өмір сүруді, сондай-ақ бауыр гомеостазын реттейтін AKT1 генінің ықтимал кандидатын атап өтеміз. Біздің зерттеуіміздің тағы бір жаңалығы - біз IPA емінің апоптозбен, жасуша морфологиясымен, митохондриялық биоэнергетикамен және LX-2 жасушаларындағы динамикамен өзара әрекеттесуін көрсеттік, бұл HSC фенотипін инактивацияға қарай жылжытатын төмен энергия спектрін көрсетеді, бұл IPA-ны бауыр фиброзын жақсартудың әлеуетті кандидаты етеді.
Біз апоптоз, митофагия және ұзақ өмір сүрудің қан айналымындағы сарысу IPA-мен байланысты бауыр гендерінде байытылған ең маңызды канондық жолдар екенін анықтадық. Митохондриялық сапаны бақылау (MQC) жүйесінің бұзылуы митохондриялық дисфункцияға, митофагияға және апоптозға әкелуі мүмкін, осылайша MASLD пайда болуына ықпал етеді [33, 34]. Сондықтан, IPA бауырда апоптоз, митофагия және ұзақ өмір сүру арқылы жасуша динамикасын және митохондриялық тұтастығын сақтауға қатысуы мүмкін деп болжауға болады. Біздің деректеріміз үш талдауда екі геннің ортақ екенін көрсетті: YKT6 және AKT1. YKT6 - жасуша мембранасының бірігу процесіне қатысатын SNARE ақуызы екенін атап өткен жөн. Ол аутофагосомада STX17 және SNAP29-мен инициациялық кешен түзу арқылы аутофагия мен митофагияда рөл атқарады, осылайша аутофагосомалар мен лизосомалардың бірігуіне ықпал етеді [35]. Сонымен қатар, YKT6 функциясының жоғалуы митофагияның бұзылуына әкеледі [36], ал YKT6 жоғарылауы гепатоцеллюлярлық карциноманың (ГКК) өршуімен байланысты, бұл жасушалардың тіршілік ету қабілетінің артуын көрсетеді [37]. Екінші жағынан, AKT1 ең маңызды өзара әрекеттесетін ген болып табылады және бауыр ауруларында, соның ішінде PI3K/AKT сигнал беру жолында, жасуша циклінде, жасуша миграциясында, пролиферациясында, фокальды адгезиясында, митохондриялық функцияда және коллаген секрециясында маңызды рөл атқарады [38–40]. Белсендірілген PI3K/AKT сигнал беру жолы жасушадан тыс матрицаның (ЭКМ) өндірілуіне жауапты жасушалар болып табылатын гемопоэтикалық бағаналы жасушаларды (ГБЖ) белсендіре алады, ал оның реттелуінің бұзылуы бауыр фиброзының пайда болуына және өршуіне ықпал етуі мүмкін [40]. Сонымен қатар, AKT p53-тәуелді жасуша апоптозын тежейтін жасушалардың тіршілік етуінің негізгі факторларының бірі болып табылады, ал AKT белсендірілуі бауыр жасушаларының апоптозының тежелуімен байланысты болуы мүмкін [41, 42]. Алынған нәтижелер IPA бауырдың митохондриямен байланысты апоптозына гепатоциттердің апоптозға енуі немесе тірі қалуы арасындағы шешіміне әсер ету арқылы қатысуы мүмкін екенін көрсетеді. Бұл әсерлер бауыр гомеостазы үшін маңызды болып табылатын AKT және/немесе YKT6 кандидат гендерімен реттелуі мүмкін.
Біздің нәтижелеріміз 1 мМ IPA TGF-β1 еміне тәуелсіз LX-2 жасушаларында апоптозды тудырып, митохондриялық тыныс алуды төмендеткенін көрсетті. Апоптоз фиброзды жоюдың және гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың (HSC) белсендірілуінің негізгі жолы және бауыр фиброзының қайтымды физиологиялық реакциясындағы негізгі оқиға екенін атап өткен жөн [4, 43]. Сонымен қатар, аралас емдеуден кейін LX-2 жасушаларында BHI қалпына келуі митохондриялық биоэнергетиканы реттеудегі IPA әлеуетті рөлі туралы жаңа түсініктер берді. Тыныштық және белсенді емес жағдайларда гемопоэтикалық жасушалар әдетте АТФ өндіру үшін митохондриялық тотығу фосфорлануын пайдаланады және метаболикалық белсенділігі төмен болады. Екінші жағынан, HSC белсенділігі гликолитикалық күйге енудің энергия қажеттіліктерін өтеу үшін митохондриялық тыныс алуды және биосинтезді күшейтеді [44]. IPA метаболикалық әлеуетке және ECAR-ға әсер етпеуі гликолитикалық жолдың онша басым емес екенін көрсетеді. Сол сияқты, тағы бір зерттеу 1 мМ IPA кардиомиоциттердегі, адам гепатоциттерінің жасуша желісіндегі (Huh7) және адам кіндік венасы эндотелий жасушаларындағы (HUVEC) митохондриялық тыныс алу тізбегінің белсенділігін модуляциялай алатынын көрсетті; Дегенмен, IPA кардиомиоциттердегі гликолизге ешқандай әсер етпеді, бұл IPA басқа жасуша түрлерінің биоэнергетикасына әсер етуі мүмкін екенін көрсетеді [45]. Сондықтан, біз 1 мМ IPA жұмсақ химиялық ажыратқыш ретінде әрекет етуі мүмкін деп болжаймыз, себебі ол mtDNA мөлшерін өзгертпестен фиброгендік ген экспрессиясын, жасуша морфологиясын және митохондриялық биоэнергетиканы айтарлықтай төмендете алады [46]. Митохондриялық ажыратқыштар культурадан туындаған фиброзды және HSC белсенділігін тежей алады [47] және ажыратқыш ақуыздар (UCP) немесе аденин нуклеотидті транслоказа (ANT) сияқты белгілі бір ақуыздармен реттелетін немесе индукцияланатын митохондриялық АТФ өндірісін азайта алады. Жасуша түріне байланысты бұл құбылыс жасушаларды апоптоздан қорғай алады және/немесе апоптозды ынталандыра алады [46]. Дегенмен, гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың инактивациясындағы митохондриялық ажыратқыш ретіндегі IPA рөлін анықтау үшін қосымша зерттеулер қажет.
Содан кейін біз митохондриялық тыныс алудың өзгерістері тірі LX-2 жасушаларындағы митохондриялық морфологияға әсер ететінін зерттедік. Қызығы, TGF-β1 емі митохондриялық пропорцияны сфералықтан аралыққа өзгертеді, митохондриялық тармақталудың төмендеуі және митохондриялық бөлінудің негізгі факторы болып табылатын DRP1 экспрессиясының жоғарылауы [48]. Сонымен қатар, митохондриялық фрагментация жалпы желінің күрделілігімен байланысты, ал бірігуден бөлінуге көшу гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың (HSC) белсенділігі үшін өте маңызды, ал митохондриялық бөлінудің тежелуі HSC апоптозына әкеледі [49]. Осылайша, біздің нәтижелеріміз TGF-β1 емі тармақталудың төмендеуімен митохондриялық желінің күрделілігінің төмендеуін тудыруы мүмкін екенін көрсетеді, бұл белсендірілген гемопоэтикалық бағаналы жасушалармен (HSC) байланысты митохондриялық бөлінуде жиі кездеседі. Сонымен қатар, біздің деректеріміз IPA митохондриялық пропорцияны сфералықтан аралық пішінге өзгерте алатынын, осылайша OPA1 және MFN2 экспрессиясын төмендете алатынын көрсетті. Зерттеулер OPA1-дің төмендеуі митохондриялық мембраналық потенциалдың төмендеуіне және жасуша апоптозын тудыруы мүмкін екенін көрсетті [50]. MFN2 митохондриялық бірігу мен апоптозды реттейтіні белгілі [51]. Алынған нәтижелер TGF-β1 және/немесе IPA арқылы LX-2 жасушаларын индукциялау митохондриялық пішін мен өлшемді, сондай-ақ белсендіру күйі мен желілік күрделілікті модуляциялайтын сияқты екенін көрсетеді.
Біздің нәтижелеріміз TGFβ-1 және IPA біріктірілген емі апоптоздан жалтаратын жасушалардағы фиброз, апоптоз және тіршілікке байланысты гендердің мРНҚ экспрессиясын реттеу арқылы мтДНҚ мен жасуша морфологиялық параметрлерін төмендетуі мүмкін екенін көрсетеді. Шынында да, IPA AKT1 мРНҚ экспрессия деңгейін және COL1A2 және MMP2 сияқты маңызды фиброз гендерін төмендетті, бірақ апоптозбен байланысты CASP8 экспрессия деңгейін арттырды. Біздің нәтижелеріміз IPA емінен кейін BAX экспрессиясы төмендегенін және TIMP1 тұқымдас суббірліктерінің, BCL-2 және NF-κB мРНҚ экспрессиясы жоғарылағанын көрсетті, бұл IPA апоптоздан жалтаратын гемопоэтикалық бағаналы жасушаларда (HSC) тіршілік сигналдарын ынталандыруы мүмкін екенін көрсетеді. Бұл молекулалар белсендірілген гемопоэтикалық бағаналы жасушаларда тірі қалу сигналдары ретінде әрекет етуі мүмкін, бұл антиапоптотикалық ақуыздардың (мысалы, Bcl-2) экспрессиясының жоғарылауымен, проапоптотикалық BAX экспрессиясының төмендеуімен және TIMP мен NF-κB арасындағы күрделі өзара әрекеттесумен байланысты болуы мүмкін [5, 7]. IPA өз әсерін PXR арқылы көрсетеді, және біз TGF-β1 және IPA-мен біріктірілген емдеу PXR мРНҚ экспрессия деңгейін арттыратынын анықтадық, бұл HSC белсенділігінің басылуын көрсетеді. Белсендірілген PXR сигнализациясы HSC белсенділігін in vivo және in vitro тежейтіні белгілі [52, 53]. Біздің нәтижелеріміз IPA апоптозды ынталандыру, фиброз бен митохондриялық метаболизмді азайту және тірі қалу сигналдарын күшейту арқылы белсендірілген HSC-лерді тазартуға қатысуы мүмкін екенін көрсетеді, бұл белсендірілген HSC фенотипін белсенді емес фенотипке айналдыратын типтік процестер. Апоптоздағы IPA-ның ықтимал механизмі мен рөлінің тағы бір ықтимал түсіндірмесі - ол дисфункционалды митохондрияларды негізінен митофагия (ішкі жол) және NF-κB тіршілік сигнал беру жолымен тікелей байланысты сыртқы TNF сигнал беру жолы (1-кесте) арқылы тазартады (қосымша 7-сурет). Қызығы, IPA-мен байланысты байытылған гендер апоптоз жолында проапоптоздық және про-тіршілік сигналдарын индукциялай алады [54], бұл IPA осы гендермен әрекеттесу арқылы апоптоздық жолды немесе тіршілікті индукциялауы мүмкін екенін көрсетеді. Дегенмен, IPA HSC белсенділігі кезінде апоптозды немесе тіршілікті қалай индукциялайтыны және оның механистік жолдары әлі күнге дейін түсініксіз.
IPA - ішек микробиотасы арқылы тағамдық триптофаннан түзілетін микробтық метаболит. Зерттеулер оның ішек ортасында қабынуға қарсы, антиоксидантты және эпигенетикалық реттеуші қасиеттерге ие екенін көрсетті.[55] Зерттеулер IPA ішек тосқауылының функциясын модуляциялай алатынын және тотығу стрессін азайта алатынын көрсетті, бұл оның жергілікті физиологиялық әсеріне ықпал етуі мүмкін.[56] Шын мәнінде, IPA қан айналымы арқылы нысана органдарға тасымалданады және IPA триптофан, серотонин және индол туындыларымен ұқсас негізгі метаболит құрылымын бөлісетіндіктен, IPA метаболикалық әсерлерді жүзеге асырады, бұл бәсекелес метаболикалық өзгерістерге әкеледі.[52] IPA ферменттер немесе рецепторлардағы байланысу орындары үшін триптофаннан алынған метаболиттермен бәсекелесуі мүмкін, бұл қалыпты метаболикалық жолдарды бұзуы мүмкін. Бұл оның терапиялық терезесін жақсырақ түсіну үшін оның фармакокинетикасы мен фармакодинамикасын одан әрі зерттеу қажеттілігін көрсетеді.[57] Мұның гемопоэтикалық бағаналы жасушаларда (ГБЖ) да болуы мүмкін бе, жоқ па, әлі белгісіз.
Біз зерттеуіміздің кейбір шектеулері бар екенін мойындаймыз. IPA-мен байланысты байланысты нақты зерттеу үшін біз 2 типті қант диабеті (2 типті қант диабеті) бар науқастарды қоспадық. Біз бұл біздің зерттеу нәтижелеріміздің 2 типті қант диабеті және бауыр ауруының асқынған түрі бар науқастарға кеңінен қолданылуын шектейтінін мойындаймыз. Адам сарысуындағы IPA физиологиялық концентрациясы 1-10 мкМ болғанымен [11, 20], 1 мМ IPA концентрациясы ең жоғары уытты емес концентрацияға [15] және апоптоздың ең жоғары жылдамдығына негізделіп таңдалды, некротикалық жасуша популяциясының пайыздық үлесінде ешқандай айырмашылық болмады. Бұл зерттеуде IPA-ның супрафизиологиялық деңгейлері қолданылғанымен, қазіргі уақытта IPA тиімді дозасы туралы консенсус жоқ [52]. Біздің нәтижелеріміз маңызды болғанымен, IPA-ның кең метаболикалық тағдыры зерттеудің белсенді саласы болып қала береді. Сонымен қатар, сарысу IPA деңгейлері мен бауыр транскрипттерінің ДНҚ метилденуі арасындағы байланыс туралы біздің зерттеу нәтижелеріміз тек гемопоэтикалық бағаналы жасушалардан (HSC) ғана емес, сонымен қатар бауыр тіндерінен де алынды. Біз транскриптомды талдаудан алынған IPA гемопоэтикалық бағаналы жасушалардың (HSC) белсенділігімен байланысты екендігі туралы бұрынғы зерттеулерімізге сүйене отырып, адам LX-2 жасушаларын пайдалануды таңдадық [15], ал HSC бауыр фиброзы дамуына қатысатын негізгі жасушалар болып табылады. Бауыр бірнеше жасуша түрлерінен тұрады, сондықтан IPA рөлін және оның басқа бауыр жасушалары түрлерімен өзара әрекеттесуін зерттеу үшін каспаза белсенділігімен және ДНҚ фрагментациясымен біріктірілген гепатоцит-HSC-иммундық жасушалардың бірлескен дақылдау жүйесі, сондай-ақ ақуыз деңгейін қоса алғанда, әсер ету механизмі сияқты басқа жасуша модельдерін қарастыру керек.