Өсімдіктерді қорғаудың әртүрлі теориялары өсімдіктердің мамандандырылған метаболизмінің заңдылықтарын түсіндіруге маңызды теориялық басшылық береді, бірақ олардың негізгі болжамдары әлі де тексерілуі керек. Мұнда біз жеке өсімдіктерден популяцияларға және тығыз байланысты түрлерге дейінгі темекі аттенуирленген штаммдарының метаболомын жүйелі түрде зерттеу үшін бейтарап тандемдік масс-спектрометрия (MS/MS) талдауын қолдандық және ақпараттағы қосылыс спектрлеріне негізделген көптеген масс-спектрометриялық ерекшелік теорияларын өңдедік. Оңтайлы қорғаныс (OD) және қозғалатын нысана (MT) теорияларының негізгі болжамдарын тексеруге арналған негіз. Өсімдік метаболомикасының ақпараттық компоненті OD теориясымен сәйкес келеді, бірақ шөпқоректілер тудыратын метаболомика динамикасына MT теориясының негізгі болжамына қайшы келеді. Микродан макроэволюциялық шкала бойынша жасмонат сигналы OD негізгі детерминанты ретінде анықталды, ал этилен сигналы MS/MS молекулалық желісімен түсіндірілген шөпқоректілерге тән реакцияны дәл реттеуді қамтамасыз етті.
Әртүрлі құрылымы бар арнайы метаболиттер өсімдіктердің қоршаған ортаға бейімделуінің, әсіресе жаулардан қорғанудың негізгі қатысушылары болып табылады (1). Өсімдіктерде кездесетін арнайы метаболизмнің таңғажайып әртараптануы оның экологиялық функцияларының көптеген аспектілері бойынша ондаған жылдар бойы терең зерттеулер жүргізуді ынталандырды және өсімдіктер мен жәндіктердің өзара әрекеттесуінің эволюциялық және экологиялық дамуы болып табылатын өсімдіктерді қорғау теорияларының ұзын тізімін қалыптастырды. Эмпирикалық зерттеулер маңызды басшылық береді (2). Дегенмен, бұл өсімдіктерді қорғау теориялары гипотетикалық дедуктивті пайымдаудың нормативтік жолын ұстанбады, онда негізгі болжамдар бірдей талдау деңгейінде болды (3) және теориялық дамудың келесі циклін алға жылжыту үшін эксперименталды түрде тексерілді (4). Техникалық шектеулер деректер жинауды нақты метаболикалық санаттарға шектейді және мамандандырылған метаболиттерді кешенді талдауды болдырмайды, осылайша теориялық даму үшін маңызды болып табылатын санатаралық салыстыруларға жол бермейді (5). Әртүрлі өсімдік топтары арасындағы метаболикалық кеңістікті өңдеу жұмыс процесін салыстыру үшін кешенді метаболомика деректерінің және ортақ валютаның болмауы саланың ғылыми жетілуіне кедергі келтіреді.
Тандемдік масс-спектрометрия (MS/MS) метаболомикасы саласындағы соңғы жетістіктер берілген жүйелік кладтың ішіндегі және түрлері арасындағы метаболикалық өзгерістерді жан-жақты сипаттай алады және осы күрделі қоспалар арасындағы құрылымдық ұқсастықты есептеу үшін есептеу әдістерімен біріктірілуі мүмкін. Химия туралы алдын ала білім (5). Талдау мен есептеудегі озық технологиялардың үйлесімі метаболикалық әртүрліліктің экологиялық және эволюциялық теориялары жасаған көптеген болжамдарды ұзақ мерзімді тексеру үшін қажетті негізді қамтамасыз етеді. Шеннон (6) 1948 жылы өзінің маңызды мақаласында алғаш рет ақпарат теориясын енгізді, бұл ақпараттың математикалық талдауының негізін қалады, ол бастапқы қолданылуынан басқа көптеген салаларда қолданылды. Геномикада ақпарат теориясы тізбекті консервативті ақпаратты сандық бағалау үшін сәтті қолданылды (7). Транскриптомика зерттеулерінде ақпарат теориясы транскриптомдағы жалпы өзгерістерді талдайды (8). Алдыңғы зерттеулерде біз өсімдіктердегі тін деңгейінің метаболикалық сараптамасын сипаттау үшін ақпарат теориясының статистикалық негізін метаболомикаға қолдандық (9). Мұнда біз шөпқоректілер тудыратын метаболоманың өсімдіктерді қорғау теориясының негізгі болжамдарын салыстыру үшін MS/MS негізіндегі жұмыс процесін ақпарат теориясының статистикалық негізімен біріктіреміз, ол ортақ валютадағы метаболикалық әртүрлілікпен сипатталады.
Өсімдіктерді қорғаудың теориялық негіздері әдетте өзара қамтылған және оларды екі санатқа бөлуге болады: қорғаныс функцияларына, мысалы, оңтайлы қорғаныс (OD) (10), қозғалатын нысана (MT) (11) және сыртқы келбет (12) теориясына негізделген өсімдікке тән метаболиттердің таралуын түсіндіруге тырысатындар, ал басқалары ресурстардың қолжетімділігінің өзгеруінің өсімдіктердің өсуіне және көміртегі: қоректік заттардың балансы гипотезасы (13), өсу жылдамдығы гипотезасы (14) және өсу және дифференциация тепе-теңдігі гипотезасы (15) сияқты мамандандырылған метаболиттердің жиналуына қалай әсер ететінін механикалық түсіндірулерді іздейді. Теориялардың екі жиынтығы талдаудың әртүрлі деңгейлерінде (4). Дегенмен, функционалдық деңгейдегі қорғаныс функцияларын қамтитын екі теория өсімдіктердің конститутивті және индуктивті қорғанысы туралы әңгімеде басымдыққа ие: өсімдіктер қымбат химиялық қорғаныстарына тек қажет болған кезде, мысалы, олар жұтылған кезде ғана инвестиция салады деп болжайтын OD теориясы. Сондықтан шөп жануары шабуыл жасағанда, болашақ шабуыл мүмкіндігіне сәйкес, қорғаныс функциясы бар қосылыс тағайындалады (10); MT гипотезасы бағыттағы метаболит өзгерісінің осі жоқ екенін, бірақ метаболит кездейсоқ өзгеретінін, осылайша шабуылдаушы шөпқоректілердің метаболикалық «қозғалыс нысанасына» кедергі келтіру мүмкіндігін тудыратынын айтады. Басқаша айтқанда, бұл екі теория шөпқоректілердің шабуылынан кейін болатын метаболикалық қайта құру туралы қарама-қарсы болжамдар жасайды: қорғаныс функциясы бар метаболиттердің бір бағытты жинақталуы (ҚҚ) және бағытталмаған метаболикалық өзгерістер (БМ) арасындағы байланыс (11).
OD және MT гипотезалары тек метаболомдағы индукцияланған өзгерістерді ғана емес, сонымен қатар осы метаболиттердің жиналуының экологиялық және эволюциялық салдарын, мысалы, белгілі бір экологиялық ортадағы осы метаболикалық өзгерістердің бейімделу шығындары мен пайдасын қамтиды (16). Екі гипотеза да қымбат болуы немесе болмауы мүмкін мамандандырылған метаболиттердің қорғаныс функциясын мойындағанымен, OD және MT гипотезаларын ажырататын негізгі болжам индукцияланған метаболикалық өзгерістердің бағыттылығында жатыр. OD теориясын болжау әзірге ең көп эксперименталды назар аударды. Бұл сынақтарға жылыжайлар мен табиғи жағдайларда нақты қосылыстардың әртүрлі тіндерінің тікелей немесе жанама қорғаныс функцияларын, сондай-ақ өсімдіктердің даму сатысындағы өзгерістерді зерттеу кіреді (17-19). Дегенмен, әзірге кез келген организмнің метаболикалық әртүрлілігін жаһандық кешенді талдау үшін жұмыс процесі мен статистикалық негіздің болмауына байланысты екі теория арасындағы негізгі айырмашылықты болжау (яғни, метаболикалық өзгерістердің бағыты) әлі де тексерілуде. Мұнда біз осындай талдауды ұсынамыз.
Өсімдікке тән метаболиттердің ең маңызды сипаттамаларының бірі - олардың жеке өсімдіктерден бастап, популяцияларға дейін барлық деңгейлердегі экстремалды құрылымдық әртүрлілігі (20). Популяция шкаласында мамандандырылған метаболиттердің көптеген сандық өзгерістерін байқауға болады, ал күшті сапалық айырмашылықтар әдетте түр деңгейінде сақталады (20). Сондықтан өсімдіктердің метаболикалық әртүрлілігі функционалдық әртүрліліктің негізгі аспектісі болып табылады, бұл әртүрлі тауашаларға, әсіресе арнайы жәндіктер мен кең таралған шөпқоректілердің әртүрлі инвазия мүмкіндіктері бар тауашаларға бейімделуді көрсетеді (21). Френкельдің (22) өсімдікке тән метаболиттердің болу себептері туралы жаңашыл мақаласынан бері әртүрлі жәндіктермен өзара әрекеттесу маңызды сұрыптау қысымы ретінде қарастырылды және бұл өзара әрекеттесулер эволюция кезінде өсімдіктерді қалыптастырды деп есептеледі. Метаболикалық жол (23). Мамандандырылған метаболиттердің әртүрлілігіндегі түраралық айырмашылықтар шөпқоректі стратегиялардан өсімдіктердің конститутивті және индуктивті қорғанысымен байланысты физиологиялық тепе-теңдікті де көрсетуі мүмкін, себебі екі түр көбінесе бір-бірімен теріс корреляцияланады (24). Жақсы қорғанысты үнемі сақтау пайдалы болуы мүмкін болса да, қорғаныспен байланысты уақтылы метаболикалық өзгерістер өсімдіктерге басқа физиологиялық инвестицияларға құнды ресурстарды бөлуге мүмкіндік беретін айқын пайда әкеледі (19, 24) және симбиоз қажеттілігін болдырмайды. Коллатеральды зақымдану (25). Сонымен қатар, жәндіктер тудыратын мамандандырылған метаболиттердің бұл қайта құрылуы популяцияда деструктивті таралуға әкелуі мүмкін (26) және популяцияда сақталуы мүмкін жасмон қышқылы (JA) сигналындағы айтарлықтай табиғи өзгерістердің тікелей көрсеткіштерін көрсетуі мүмкін. Жоғары және төмен JA сигналдары шөпқоректілерге қарсы қорғаныс пен белгілі бір түрлермен бәсекелестік арасындағы ымыра болып табылады (27). Сонымен қатар, мамандандырылған метаболит биосинтетикалық жолдары эволюция кезінде тез жоғалып, трансформацияға ұшырайды, бұл тығыз байланысты түрлер арасында метаболикалық таралудың біркелкі болмауына әкеледі (28). Бұл полиморфизмдер шөпқоректілердің өзгеруіне жауап ретінде тез орнатылуы мүмкін (29), бұл шөпқоректі қауымдастықтардың ауытқуы метаболикалық гетерогенділікті тудыратын негізгі фактор екенін білдіреді.
Мұнда біз келесі мәселелерді нақты шештік. (I) Шөпқоректі жәндік өсімдік метаболомын қалай қайта конфигурациялайды? (Ii) Ұзақ мерзімді қорғаныс теориясының болжамдарын тексеру үшін сандық түрде анықтауға болатын метаболикалық пластиканың негізгі ақпараттық компоненттері қандай? (Iii) Өсімдік метаболомын шабуылдаушыға ғана тән тәсілмен қайта бағдарламалау керек пе, егер солай болса, өсімдік гормоны белгілі бір метаболикалық жауапты бейімдеуде қандай рөл атқарады және қандай метаболиттер қорғаныстың түрлік ерекшелігіне ықпал етеді? (IV) Көптеген қорғаныс теориялары жасаған болжамдарды биологиялық тіндердің барлық деңгейлеріне кеңейтуге болатындықтан, біз туындаған метаболикалық реакцияның ішкі салыстырудан түраралық салыстыруға дейін қаншалықты сәйкес келетінін сұрадық. Осы мақсатта біз темекі никотинінің жапырақ метаболомын жүйелі түрде зерттедік, ол бай мамандандырылған метаболизмі бар экологиялық модельдік өсімдік болып табылады және екі жергілікті шөпқоректілердің, Lepidoptera Datura (Ms) дернәсілдеріне қарсы тиімді (өте агрессивті, негізінен жеуге жарамды). Solanaceae және Spodoptera littoralis (Sl) өсімдіктерінде мақта жапырағы құрттары Solanaceae ие өсімдіктері және басқа да тұқымдастар мен тұқымдастардың иелері бар «туыс» түрі болып табылады. Өсімдік тағамы. Біз MS/MS метаболомика спектрін талдадық және OD және MT теорияларын салыстыру үшін ақпарат теориясының статистикалық сипаттамаларын алдық. Негізгі метаболиттердің сәйкестігін анықтау үшін ерекшелік карталарын жасадық. Талдау өсімдік гормонының сигнализациясы мен OD индукциясы арасындағы ковариантты одан әрі талдау үшін N. nasi және тығыз байланысты темекі түрлерінің жергілікті популяциясына кеңейтілді.
Шөпқоректі темекінің жапырақ метаболомының пластикасы мен құрылымы туралы жалпы картаны алу үшін біз өсімдік сығындыларынан жоғары ажыратымдылықтағы деректерге тәуелсіз MS/MS спектрлерін кешенді жинау және деконволюциялау үшін бұрын жасалған талдау мен есептеу жұмыс процесін пайдаландық (9). Бұл дифференциалданбаған әдіс (MS/MS деп аталады) артық емес қосылыс спектрлерін құра алады, оларды содан кейін мұнда сипатталған барлық қосылыс деңгейіндегі талдаулар үшін пайдалануға болады. Бұл деконволюцияланған өсімдік метаболиттері әртүрлі типте болады, олар жүздегеннен мыңдаған метаболиттерден тұрады (мұнда шамамен 500-1000-с/MS/MS). Мұнда біз ақпарат теориясы шеңберінде метаболикалық пластиканы қарастырамыз және метаболизм жиілігінің таралуының Шеннон энтропиясына негізделген метаболоманың әртүрлілігі мен кәсібилігін сандық түрде анықтаймыз. Бұрын енгізілген формуланы (8) пайдаланып, біз метаболоманың әртүрлілігін (Hj индикаторы), метаболикалық профильдің мамандануын (δj индикаторы) және бір метаболиттің метаболикалық ерекшелігін (Si индикаторы) сандық түрде анықтау үшін пайдалануға болатын индикаторлар жиынтығын есептедік. Сонымен қатар, біз шөпқоректілердің метаболом индуктивтілігін сандық бағалау үшін салыстырмалы қашықтық пластикалық индексін (RDPI) қолдандық (1A сурет) (30). Осы статистикалық шеңберде біз MS/MS спектрін негізгі ақпарат бірлігі ретінде қарастырамыз және MS/MS салыстырмалы молдығын жиілік таралу картасына өңдейміз, содан кейін одан метаболом әртүрлілігін бағалау үшін Шеннон энтропиясын қолданамыз. Метаболомның мамандануы бір MS/MS спектрінің орташа ерекшелігімен өлшенеді. Сондықтан, шөпқоректілерді индукциялағаннан кейін кейбір MS/MS кластарының молшылығының артуы спектрлік индуктивтілікке, RDPI және мамандануға, яғни δj индексінің артуына айналады, себебі көбірек мамандандырылған метаболиттер түзіледі және жоғары Si индексі түзіледі. Hj әртүрлілік индексінің төмендеуі не түзілген MS/MS санының азаятынын, не профиль жиілігінің таралуының біркелкі емес бағытта өзгеретінін көрсетеді, сонымен бірге оның жалпы белгісіздігін азайтады. Si индексін есептеу арқылы белгілі бір шөпқоректі жануарлар қандай MS/MS индукциялайтынын, керісінше, қай MS/MS индукцияға жауап бермейтінін анықтауға болады, бұл MT және OD болжамын ажыратудың негізгі көрсеткіші болып табылады.
(A) Шөпқоректі (H1-ден Hx-ке дейін) MS/MS деректерінің индуктивтілігі (RDPI), әртүрлілік (Hj индексі), мамандану (δj индексі) және метаболиттердің ерекшелігі (Si индексі) үшін қолданылатын статистикалық сипаттамалар. Мамандану дәрежесінің жоғарылауы (δj) орташа есеппен шөпқоректілерге тән метаболиттердің көбірек өндірілетінін көрсетеді, ал әртүрліліктің төмендеуі (Hj) метаболиттердің өндірісінің төмендеуін немесе таралу картасында метаболиттердің біркелкі емес таралуын көрсетеді. Si мәні метаболиттің берілген жағдайға тән екенін (мұнда шөпқоректі) немесе керісінше сол деңгейде сақталатынын бағалайды. (B) Ақпараттық теория осін пайдаланып қорғаныс теориясын болжаудың тұжырымдамалық диаграммасы. OD теориясы шөпқоректілердің шабуылы қорғаныс метаболиттерін арттыратынын, осылайша δj артатынын болжайды. Сонымен қатар, Hj азаяды, себебі профиль метаболикалық ақпараттың белгісіздігінің төмендеуіне қарай қайта құрылады. MT теориясы шөпқоректілердің шабуылы метаболомада бағытталмаған өзгерістерге әкелетінін, осылайша метаболикалық ақпараттың белгісіздігінің жоғарылауының көрсеткіші ретінде Hj артатынын және Si кездейсоқ таралуын тудыратынын болжайды. Біз сондай-ақ аралас модельді, ең жақсы MT-ны ұсындық, онда қорғаныс мәндері жоғары кейбір метаболиттер ерекше жоғарылайды (жоғары Si мәні), ал басқалары кездейсоқ реакциялар көрсетеді (төмен Si мәні).
Ақпараттық теория дескрипторларын пайдалана отырып, біз OD теориясын шөпқоректі жануарлардың индукцияланбаған конститутивті күйдегі арнайы метаболит өзгерістері (i) метаболикалық ерекшеліктің жоғарылауына (Si индексі), метабономикалық ерекшеліктің жоғарылауына (δj индексі) және (ii) метаболикалық жиілік таралуының лептин денесінің таралуына көбірек өзгеруіне байланысты метаболом әртүрлілігінің төмендеуіне (Hj индексі) әкелетінін болжау үшін түсіндіреміз. Бір метаболит деңгейінде реттелген Si таралуы күтіледі, мұнда метаболит қорғаныс мәніне сәйкес Si мәнін арттырады (1B сурет). Осыған байланысты біз қозу (i) метаболиттердің бағытталмаған өзгерістеріне әкелетінін және (ii) метаболикалық белгісіздіктің жоғарылауына байланысты Hj индексінің жоғарылауына әкелетінін болжау үшін MT теориясын түсіндіреміз. Немесе кездейсоқтық, оны Шеннон энтропиясымен жалпыланған әртүрлілік түрінде сандық түрде анықтауға болады. Метаболикалық құрамға келетін болсақ, MT теориясы Si кездейсоқ таралуын болжайды. Белгілі бір метаболиттер белгілі бір жағдайларда белгілі бір жағдайларда болатынын, ал басқалары нақты жағдайларда болмайтынын және олардың қорғаныс құндылығы қоршаған ортаға байланысты екенін ескере отырып, біз аралас қорғаныс моделін де ұсындық, онда δj және Hj Si бойымен екіге бөлінеді. Барлық бағыттар бойынша артады, тек қорғаныс мәндері жоғары белгілі бір метаболит топтары ғана Si-ді ерекше арттырады, ал басқаларында кездейсоқ таралу болады (1B сурет).
Ақпараттық теория дескрипторының осінде қайта анықталған қорғаныс теориясының болжамын тексеру үшін біз Nepenthes pallens жапырақтарында сарапшы (Ms) немесе жалпы (Sl) шөпқоректі жануарлардың дернәсілдерін өсірдік (2A сурет). MS/MS талдауын қолдана отырып, біз құртпен қоректенгеннен кейін жиналған жапырақ тінінің метанол сығындыларынан 599 артық емес MS/MS спектрлерін (S1 деректер файлы) алдық. MS/MS конфигурация файлдарындағы ақпарат мазмұнының қайта конфигурациясын визуализациялау үшін RDPI, Hj және δj индекстерін пайдалану қызықты заңдылықтарды ашады (2B сурет). Жалпы үрдіс, ақпараттық дескрипторда сипатталғандай, құрттар жапырақтарды жеуді жалғастырған сайын, барлық метаболикалық қайта құру дәрежесі уақыт өте келе артады: шөпқоректі жануарлар жегеннен кейін 72 сағаттан кейін RDPI айтарлықтай артады. Зақымдалмаған бақылаумен салыстырғанда, Hj айтарлықтай төмендеді, бұл метаболикалық профильдің мамандану дәрежесінің артуына байланысты болды, ол δj индексімен сандық түрде анықталды. Бұл айқын үрдіс OD теориясының болжамдарына сәйкес келеді, бірақ метаболит деңгейлерінің кездейсоқ (бағытсыз) өзгерістері қорғаныс камуфляжы ретінде пайдаланылады деп санайтын MT теориясының негізгі болжамдарына сәйкес келмейді (1B сурет). Бұл екі шөпқоректі жануарлардың ауыз арқылы секреция (OS) қоздырғышының құрамы мен қоректену мінез-құлқы әртүрлі болғанымен, оларды тікелей қоректендіргенде 24 сағаттық және 72 сағаттық жинау кезеңдерінде Hj және δj бағыттарында ұқсас өзгерістер болды. Жалғыз айырмашылық RDPI-дің 72 сағатында болды. Ms қоректенуінен туындаған айырмашылықпен салыстырғанда, Sl қоректенуінен туындаған жалпы метаболизм жоғары болды.
(A) Эксперименттік жоба: кәдімгі шошқа (S1) немесе сарапшы (Ms) шөпқоректілер құмыра өсімдіктерінің тұзсыздандырылған жапырақтарымен қоректенеді, ал модельденген шөпқоректілер үшін Ms OS (W + OSMs) стандартталған жапырақ позицияларының жараланған жерлерін тесу үшін қолданылады. S1 (W + OSSl) дернәсілдері немесе су (W + W). Бақылау (C) - зақымдалмаған жапырақ. (B) Арнайы метаболит картасы үшін есептелген индуктивтілік (RDPI бақылау диаграммасымен салыстырғанда), әртүрлілік (Hj индексі) және мамандану (δj индексі) индексі (599 MS/MS; деректер файлы S1). Жұлдызшалар тікелей шөпқоректілермен қоректену мен бақылау тобы арасындағы айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (жұптасқан t-тестімен Студенттің t-тестісі, *P<0,05 және ***P<0,001). ns, маңызды емес. (C) Модельденген шөпқоректі емдеуден кейінгі негізгі (көк жәшік, аминқышқылы, органикалық қышқыл және қант; деректер файлы S2) және арнайы метаболит спектрінің (қызыл жәшік 443 MS/MS; деректер файлы S1) уақыт бойынша ажыратымдылық индексі. Түсті жолақ 95% сенімділік аралығын білдіреді. Жұлдызша емдеу мен бақылау арасындағы айтарлықтай айырмашылықты көрсетеді [дисперсияның квадраттық талдауы (ANOVA), содан кейін post hoc көптік салыстырулар үшін Tukey-дің шынымен маңызды айырмашылығы (HSD), *P<0.05, **P<0.01 және *** P <0.001]. (D) Шашыраңқы графиктер мен арнайы метаболит профильдерінің мамандандырылуы (әртүрлі өңдеулермен қайталанатын үлгілер).
Шөпқоректілердің метаболом деңгейіндегі қайта құрылуы жеке метаболиттер деңгейінің өзгеруінде көрініс табатынын зерттеу үшін біз алдымен Nepenthes pallens жапырақтарында бұрын зерттелген, шөпқоректілерге төзімділігі дәлелденген метаболиттерге назар аудардық. Фенолдық амидтер - жәндіктердің шөпқоректілік процесінде жиналатын және жәндіктердің өнімділігін төмендететіні белгілі гидроксициннамамид-полиамин конъюгаттары (32). Біз сәйкес MS/MS прекурсорларын іздеп, олардың кумулятивті кинетикалық қисықтарын сыздық (S1 сурет). Таңқаларлық емес, хлороген қышқылы (CGA) және рутин сияқты шөпқоректілерден қорғануға тікелей қатыспайтын фенол туындылары шөпқоректіліктен кейін төмендейді. Керісінше, шөпқоректілер фенол амидтерін өте күшті ете алады. Екі шөпқоректінің үздіксіз қоректенуі феноламидтердің қоздыру спектрінің бірдей дерлік пайда болуына әкелді және бұл үлгі феноламидтердің de novo синтезі үшін әсіресе айқын болды. Дәл осындай құбылыс 17-гидроксигеранилнонандиол дитерпен гликозидтерінің (17-HGL-DTGs) жолын зерттеген кезде де байқалады, ол тиімді шөпқоректілерге қарсы функциялары бар көптеген ациклді дитерпендерді шығарады (33), оның ішінде Ms Feeding with Sl ұқсас экспрессия профилін іске қосты (S1 сурет)).
Шөпқоректі жануарларды тікелей тамақтандыру тәжірибелерінің кемшілігі - шөпқоректі жануарлардың жапырақты тұтыну жылдамдығы мен тамақтандыру уақытындағы айырмашылық, бұл жаралар мен шөпқоректі жануарлардан туындаған шөпқоректі жануарларға тән әсерлерді жоюды қиындатады. Индукцияланған жапырақ метаболикалық реакциясының шөпқоректі жануарлар түрлерінің ерекшелігін жақсырақ шешу үшін біз жаңадан жиналған OS (OSM және OSS1) жапырақтардың тұрақты позицияларының стандартты пункциясы W-ге дереу қолдану арқылы Ms және Sl дернәсілдерін тамақтандыруды модельдедік. Бұл процедура W + OS емдеу деп аталады және ол тіндердің жоғалу жылдамдығында немесе мөлшерінде айырмашылықтардың шатастыратын әсерлерін тудырмай, шөпқоректі жануарлар тудырған реакцияның басталуын дәл уақытында белгілеу арқылы индукцияны стандарттайды (2A сурет) (34). MS/MS талдау және есептеу құбырын пайдаланып, біз тікелей тамақтандыру тәжірибелерінен бұрын жиналған спектрлермен қабаттасатын 443 MS/MS спектрін (S1 деректер файлы) алдық. Осы MS/MS деректер жиынтығының ақпараттық теориялық талдауы шөпқоректілерді модельдеу арқылы жапыраққа мамандандырылған метаболомдарды қайта бағдарламалау OS-ға тән индукцияларды көрсеткенін көрсетті (2C сурет). Атап айтқанда, OSS1 емімен салыстырғанда, OSM 4 сағат ішінде метаболом мамандануының жоғарылауына әкелді. Тікелей шөпқоректілерді тамақтандыру эксперименттік деректер жиынтығымен салыстырғанда, Hj және δj координаттары ретінде екі өлшемді кеңістікте көрінетін метаболикалық кинетика және уақыт өте келе модельденген шөпқоректілерді емдеуге жауап ретінде метаболом мамандануының бағыттылығы көрсетілгенін атап өткен жөн. Өсу тұрақты (2D сурет). Сонымен қатар, метаболом сараптамасының бұл мақсатты өсуі модельденген шөпқоректілерге жауап ретінде орталық көміртек метаболизмінің қайта конфигурациялануына байланысты ма екенін зерттеу үшін аминқышқылдарының, органикалық қышқылдардың және қанттардың мөлшерін (S2 деректер файлы) сандық түрде анықтадық (S2 сурет). Бұл үлгіні жақсырақ түсіндіру үшін біз бұрын талқыланған феноламид пен 17-HGL-DTG жолдарының метаболикалық жинақталу кинетикасын одан әрі бақыладық. Шөпқоректі жануарлардың ОС-спецификалық индукциясы феноламид метаболизмі аясында дифференциалды қайта құру үлгісіне айналады (S3-сурет). Кумарин мен кофеин бөліктері бар фенолдық амидтер OSS1 арқылы басым түрде индукцияланады, ал ОСМ-дер ферулил конъюгаттарының спецификалық индукциясын тудырады. 17-HGL-DTG жолы үшін төменгі ағымдағы малонилдену және дималонилдену өнімдерімен дифференциалды ОС индукциясы анықталды (S3-сурет).
Әрі қарай, біз шөпқоректі жануарлардағы розетка өсімдігінің жапырақтарын емдеу үшін OSM қолдануды модельдейтін уақыттық микрочип деректер жиынтығын пайдаланып, ОС индукцияланған транскриптом пластикасын зерттедік. Іріктеу кинетикасы негізінен осы метаболомика зерттеуінде қолданылған кинетикамен сәйкес келеді (35). Метаболикалық пластика уақыт өте келе ерекше артатын метаболомды қайта конфигурациялаумен салыстырғанда, біз Ms индукциялаған жапырақтардағы өтпелі транскрипция жарылыстарын байқаймыз, мұнда транскриптом индуктивтілігі (RDPI) және мамандану (δj) 1-де. Бұл уақытта сағаттардың айтарлықтай өсуі және әртүрлілік (Hj) байқалды, BMP1 экспрессиясы айтарлықтай төмендеді, содан кейін транскриптом мамандануының босаңсуы байқалды (S4 сурет). Метаболикалық ген отбасылары (мысалы, P450, гликозилтрансфераза және BAHD ацилтрансфераза) жоғарыда аталған ерте жоғары мамандану моделіне сәйкес бастапқы метаболизмнен алынған құрылымдық бірліктерден арнайы метаболиттерді жинау процесіне қатысады. Нақты жағдай ретінде фенилаланин жолы талданды. Талдау феноламид метаболизміндегі негізгі гендердің шөпқоректілерде тартылмаған өсімдіктермен салыстырғанда OS-индукцияланатынын және олардың экспрессия үлгілері бойынша тығыз байланысты екенін растады. Осы жолдың жоғарғы жағындағы транскрипция факторы MYB8 және PAL1, PAL2, C4H және 4CL құрылымдық гендерінде транскрипцияның ерте басталуы байқалды. Феноламидтің соңғы жиналуында рөл атқаратын ацилтрансферазалар, мысалы, AT1, DH29 және CV86, ұзаққа созылған жоғары реттелу үлгісін көрсетеді (S4 сурет). Жоғарыдағы бақылаулар транскриптом мамандануының ерте басталуы және метаболомика мамандануының кейінірек күшеюі біріктірілген режим екенін көрсетеді, бұл күшті қорғаныс реакциясын бастайтын синхронды реттеу жүйесіне байланысты болуы мүмкін.
Өсімдік гормондарының сигнал беруіндегі қайта конфигурация өсімдіктердің физиологиясын қайта бағдарламалау үшін шөпқоректі ақпаратты біріктіретін реттеуші қабат ретінде әрекет етеді. Шөпқоректілерді модельдеуден кейін біз өсімдік гормондарының негізгі санаттарының жинақталған динамикасын өлшеп, олардың арасындағы уақытша бірлескен экспрессияны көрнекі түрде көрсеттік [Пирсон корреляция коэффициенті (PCC)> 0,4] (3A сурет). Күтілгендей, биосинтезге қатысты өсімдік гормондары өсімдік гормондарының бірлескен экспрессия желісінде байланысты. Сонымен қатар, әртүрлі емдеу арқылы индукцияланған өсімдік гормондарын көрсету үшін метаболикалық ерекшелік (Si индексі) осы желіге бейнеленген. Шөпқоректілерге тән реакцияның екі негізгі саласы көрсетілген: бірі JA кластерінде, мұнда JA (оның биологиялық белсенді түрі JA-Ile) және басқа JA туындылары ең жоғары Si ұпайын көрсетеді; екіншісі - этилен (ET). Гиббереллин шөпқоректілерге тән ерекшеліктің орташа өсуін ғана көрсетті, ал цитокинин, ауксин және абсциз қышқылы сияқты басқа өсімдік гормондары шөпқоректілер үшін төмен индукциялық ерекшелікке ие болды. Тек W + W қолданумен салыстырғанда, JA туындыларының шың мәнінің OS қолданбасы (W + OS) арқылы күшеюі негізінен JA-лардың күшті спецификалық индикаторына айналуы мүмкін. Күтпеген жерден, әртүрлі экзиторлық құрамы бар OSM және OSS1 JA және JA-Ile-дің ұқсас жиналуын тудыратыны белгілі. OSS1-ден айырмашылығы, OSM OSM-дермен арнайы және күшті түрде индукцияланады, ал OSS1 базальды жаралардың реакциясын күшейтпейді (3B сурет).
(A) Шөпқоректі жануарлардан туындаған өсімдік гормондарының жинақталу кинетикасын модельдеудің PCC есептеуіне негізделген бірлескен экспрессия желісін талдау. Түйін бір өсімдік гормонын білдіреді, ал түйіннің өлшемі емдеу арасындағы өсімдік гормонына тән Si индексін білдіреді. (B) Әртүрлі түстермен көрсетілген әртүрлі емдеуден туындаған жапырақтарда JA, JA-Ile және ET жинақталуы: өрік, W + OSM; көк, W + OSSl; қара, W + W; сұр, C (бақылау). Жұлдызшалар емдеу мен бақылау арасындағы айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (екі жақты ANOVA, содан кейін Tukey HSD post hoc көптік салыстыруы, *** P <0,001). ET сигналы бұзылған ETR1-дегі JA биосинтезіндегі және қабылдау спектрінің бұзылуындағы (irAOC және irCOI1) (C)697 MS/MS (деректер файлы S1) және (D)585 MS/MS (деректер файлы S1) ақпараттық теориялық талдауы. Екі модельденген шөпқоректі емдеу өсімдік желілерін және бос көлік құралын (EV) бақылау өсімдіктерін іске қосты. Жұлдызшалар W+OS емі мен зақымдалмаған бақылау арасындағы айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетеді (екі жақты ANOVA, содан кейін Tukey HSD post hoc көптік салыстыруы, *P<0.05, **P<0.01 және ***P<0.001). (E) Мамандануға шашыраңқы қарсылықтың шашыраңқы графиктері. Түстер әртүрлі генетикалық түрлендірілген штамдарды білдіреді; таңбалар әртүрлі емдеу әдістерін білдіреді: үшбұрыш, W + OSS1; тіктөртбұрыш, W + OSM; шеңбер C
Келесіде, біз JA және ET биосинтезінің (irAOC және irACO) және қабылдаудың (irCOI1 және sETR1) негізгі кезеңдерінде осы екі өсімдік гормонының шөпқоректілердегі метаболизмін талдау үшін генетикалық түрлендірілген әлсіреген Непентес штаммын (irCOI1 және sETR1) қолданамыз. Қайта бағдарламалаудың салыстырмалы үлесі. Алдыңғы тәжірибелерге сәйкес, біз бос тасымалдаушы (EV) өсімдіктерде шөпқоректі-OS индукциясын (3-сурет, C-дан D-ға дейін) және OSM тудырған Hj индексінің жалпы төмендеуін растадық, ал δj индексі артты. Жауап OSS1 тудырған жауапқа қарағанда айқынырақ. Hj және δj координаталарын пайдаланатын екі жолақты график нақты реттелуді көрсетеді (3E сурет). Ең айқын үрдіс - JA сигналы жоқ штамдарда шөпқоректілер тудырған метаболомдық әртүрлілік пен мамандану өзгерістері толығымен жойылады (3C сурет). Керісінше, sETR1 өсімдіктеріндегі үнсіз ET қабылдауы, шөпқоректі метаболизмнің өзгеруіне жалпы әсері JA сигнализациясына қарағанда әлдеқайда төмен болса да, OSM және OSS1 қоздырулары арасындағы Hj және δj индекстерінің айырмашылығын әлсіретеді (3D сурет және S5 сурет). Бұл JA сигналының трансдукциясының негізгі функциясынан басқа, ET сигналының трансдукциясы шөпқоректілердің түрге тән метаболикалық реакциясын дәл баптау қызметін де атқаратынын көрсетеді. Осы дәл баптау функциясына сәйкес, sETR1 өсімдіктеріндегі жалпы метаболом индуктивтілігінде ешқандай өзгеріс болған жоқ. Екінші жағынан, sETR1 өсімдіктерімен салыстырғанда, irACO өсімдіктері шөпқоректілер тудырған метаболикалық өзгерістердің ұқсас жалпы амплитудаларын тудырды, бірақ OSM және OSS1 қиындықтары арасында айтарлықтай әртүрлі Hj және δj ұпайларын көрсетті (S5 сурет).
Шөпқоректілердің түрге тән реакциясына маңызды үлес қосатын мамандандырылған метаболиттерді анықтау және олардың ET сигналдары арқылы өндірілуін дәл баптау үшін біз бұрын жасалған құрылымдық MS/MS әдісін қолдандық. Бұл әдіс MS/MS фрагменттерінен [қалыпқа келтірілген нүктелік өнім (NDP)] және бейтарап жоғалтуға (NL) негізделген ұқсастық ұпайынан метаболикалық тұқымдасты қайта анықтау үшін екі кластерлеу әдісіне негізделген. ET трансгендік желілерін талдау арқылы құрылған MS/MS деректер жиынтығы 585 MS/MS (S1 деректер файлы) берді, бұл оларды жеті негізгі MS/MS модуліне (M) кластерлеу арқылы шешілді (4A сурет). Бұл модульдердің кейбіреулері бұрын сипатталған арнайы метаболиттермен тығыз байланысты: мысалы, M1, M2, M3, M4 және M7 әртүрлі фенол туындыларына (M1), флавоноид гликозидтеріне (M2), ацил қанттарына (M3 және M4) және 17-HGL-DTG (M7) бай. Сонымен қатар, әрбір модульдегі бір метаболиттің метаболикалық ерекшелігі (Si индексі) есептеледі және оның Si таралуын интуитивті түрде көруге болады. Қысқасы, жоғары шөпқоректілік және генотиптік ерекшелікті көрсететін MS/MS спектрлері жоғары Si мәндерімен сипатталады, ал куртоз статистикасы оң жақ құйрық бұрышындағы жүннің таралуын көрсетеді. Осындай арық коллоидтық таралудың бірі M1-де анықталды, онда фенол амид ең жоғары Si фракциясын көрсетті (4B сурет). M7-дегі бұрын аталған шөпқоректі индуктивті 17-HGL-DTG орташа Si ұпайын көрсетті, бұл екі OS түрі арасындағы орташа дәрежедегі дифференциалды реттеуді көрсетеді. Керісінше, рутин, CGA және ацил қанттары сияқты конститутивті түрде өндірілген мамандандырылған метаболиттердің көпшілігі ең төменгі Si ұпайларының қатарына жатады. Арнайы метаболиттер арасындағы құрылымдық күрделілік пен Si таралуын жақсырақ зерттеу үшін әрбір модуль үшін молекулалық желі құрылды (4B сурет). OD теориясының маңызды болжамы (1B суретте қысқаша көрсетілген) - шөпқоректілерден кейін арнайы метаболиттердің қайта құрылуы жоғары қорғаныс құндылығы бар метаболиттерде бір жақты өзгерістерге әкелуі керек, әсіресе олардың ерекшелігін арттыру арқылы (кездейсоқ таралудан айырмашылығы) Mode) MT теориясымен болжанған қорғаныс метаболиті. M1-де жинақталған фенол туындыларының көпшілігі жәндіктердің өнімділігінің төмендеуімен функционалды түрде байланысты (32). 24 сағат ішінде индукцияланған жапырақтар мен EV бақылау өсімдіктерінің құрамдас жапырақтары арасындағы M1 метаболиттеріндегі Si мәндерін салыстырған кезде, біз шөпқоректі жәндіктерден кейін көптеген метаболиттердің метаболикалық ерекшелігінің айтарлықтай өсу үрдісі бар екенін байқадық (4C сурет). Si мәнінің меншікті өсуі тек қорғаныс феноламидтерінде ғана анықталды, бірақ осы модульде бірге өмір сүретін басқа фенолдар мен белгісіз метаболиттерде Si мәнінің жоғарылауы анықталмады. Бұл OD теориясымен байланысты мамандандырылған модель. Шөпқоректілер тудыратын метаболикалық өзгерістердің негізгі болжамдары сәйкес келеді. Феноламид спектрінің бұл ерекшелігінің OS-спецификалық ET арқылы индукцияланғанын тексеру үшін біз метаболиттің Si индексін сызып, EV және sETR1 генотиптерінде OSM мен OSS1 арасындағы дифференциалды экспрессия мәнін анықтадық (4D сурет). sETR1-де фенамид тудырған OSM мен OSS1 арасындағы айырмашылық айтарлықтай азайды. Бикластерлеу әдісі JA-реттелетін метаболикалық мамандануға қатысты негізгі MS/MS модульдерін анықтау үшін жеткіліксіз JA бар штамдарда жиналған MS/MS деректеріне де қолданылды (S6 сурет).
(A) 585 MS/MS кластерлеу нәтижелері ортақ фрагментке (NDP ұқсастығы) және ортақ бейтарап жоғалтуға (NL ұқсастығы) негізделген, (M) модулінің белгілі қосылыс тұқымдасына немесе белгісіз немесе нашар метаболизденген метаболит құрамына сәйкес келуіне әкеледі. Әрбір модульдің жанында метаболиттің (MS/MS) ерекше (Si) таралуы көрсетілген. (B) Модульдік молекулалық желі: Түйіндер MS/MS және шеттерін, NDP (қызыл) және NL (көк) MS/MS ұпайларын білдіреді (шектеу, > 0,6). Бағаланған метаболиттің ерекшелік индексі (Si) модульге негізделген (сол жақта) боялған және молекулалық желіге (оң жақта) бейнеленген. (C) 24 сағат ішінде конститутивті (бақылау) және индукцияланған күйдегі (модельденген шөпқоректі) EV өсімдігінің M1 модулі: молекулалық желі диаграммасы (Si мәні - түйін өлшемі, қорғаныс феноламиді көк түспен белгіленген). (D) EV және ET қабылдауы бұзылған sETR1 спектр сызығының M1 молекулалық желі диаграммасы: жасыл шеңбер түйінімен көрсетілген фенолдық қосылыс және W + OSM және W + OSS1 өңдеулері арасындағы түйін өлшемі ретіндегі маңызды айырмашылық (P мәні). CP, N-кофеоил-тирозин; CS, N-кофеоил-спермидин; FP, N-ферул қышқылы эфир-зәр қышқылы; FS, N-ферулил-спермидин; CoP, N', N “-Кумаролил-тирозин; DCS, N', N”-дикаффеоил-спермидин; CFS, N', N”-кофеоил, ферулоил-спермидин; Wolfberry Son құрамындағы Lycium barbarum; Ник. O-AS, O-ацил қант.
Біз талдауды бір ғана әлсіреген Непентес генотипінен табиғи популяцияларға дейін кеңейттік, мұнда шөпқоректі JA деңгейлеріндегі және нақты метаболит деңгейлеріндегі күшті түрішілік өзгерістер бұрын табиғи популяцияларда сипатталған (26). Бұл деректер жиынтығын 43 гермоплазманы қамту үшін пайдаланыңыз. Бұл гермоплазмалар N. pallens өсімдіктерінің 123 түрінен тұрады. Бұл өсімдіктер Юта, Невада, Аризона және Калифорниядағы әртүрлі жергілікті мекендеу орталарында жиналған тұқымдардан алынды (S7-сурет), біз метаболомдық әртүрлілікті (мұнда популяция деңгейі деп аталады) β әртүрлілікті) және OSM тудырған мамандануды есептедік. Алдыңғы зерттеулерге сәйкес, біз Hj және δj осьтері бойымен метаболикалық өзгерістердің кең ауқымын байқадық, бұл гермоплазмалардың шөпқоректілерге метаболикалық реакцияларының икемділігінде айтарлықтай айырмашылықтар бар екенін көрсетеді (S7-сурет). Бұл ұйымдасу шөпқоректілер тудырған JA өзгерістерінің динамикалық диапазоны туралы бұрынғы бақылауларды еске түсіреді және бір популяцияда өте жоғары мәнді сақтап қалды (26, 36). Hj және δj арасындағы жалпы деңгей корреляциясын тексеру үшін JA және JA-Ile пайдалану арқылы біз JA мен метаболом β әртүрлілігі мен мамандану индексі арасында айтарлықтай оң корреляция бар екенін анықтадық (S7-сурет). Бұл популяция деңгейінде анықталған JA индукциясындағы шөпқоректі жануарлар тудыратын гетерогенділік жәндіктердің шөпқоректі жануарлардан іріктеуден туындаған негізгі метаболикалық полиморфизмдерге байланысты болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Алдыңғы зерттеулер темекі түрлерінің түрі және индукцияланған және конститутивті метаболикалық қорғанысқа салыстырмалы тәуелділігі бойынша айтарлықтай ерекшеленетінін көрсетті. Шөпқоректілерге қарсы сигнал берудегі және қорғаныс қабілеттеріндегі бұл өзгерістер жәндіктер популяциясының қысымымен, өсімдіктердің тіршілік циклімен және берілген түр өсетін жердегі қорғаныс өндірісінің шығындарымен реттеледі деп есептеледі. Біз Солтүстік Америка мен Оңтүстік Америкада мекендейтін алты Nicotiana түрінің шөпқоректілері тудыратын жапырақ метаболомының қайта құрылуының тұрақтылығын зерттедік. Бұл түрлер Солтүстік Американың Непентесімен, атап айтқанда Nicolias Bociflo-мен тығыз байланысты. La, N. nicotinis, Nicotiana n. әлсіреген шөп, Nicotiana tabacum, сызықты темекі, темекі (Nicotiana spegazzinii) және темекі жапырағының темекісімен (Nicotiana obtusifolia) (5A сурет) (37). Осы түрлердің алтауы, соның ішінде жақсы сипатталған N. please түрлері, петуния кладасының біржылдық өсімдіктері, ал obtusifolia N. Trigonophyllae апалы-сіңлілі кладасының көпжылдық өсімдіктері (38). Кейіннен, жәндіктердің қоректенуінің түр деңгейіндегі метаболикалық қайта құрылуын зерттеу үшін осы жеті түрге W + W, W + OSM және W + OSS1 индукциясы жүргізілді.
(A) Максималды ықтималдыққа [ядролық глутамин синтезі үшін (38)] және жеті тығыз байланысты Nicotiana түрінің (әртүрлі түстер) географиялық таралуына (37) негізделген бастапқы филогенетикалық ағаш. (B) Жеті Nicotiana түрінің метаболикалық профильдері үшін мамандандырылған әртүрліліктің шашыраңқы графигі (939 MS/MS; S1 деректер файлы). Түр деңгейінде метаболомдық әртүрлілік мамандану дәрежесімен теріс корреляцияланады. Метаболикалық әртүрлілік пен мамандану мен JA жинақталуы арасындағы түр деңгейіндегі корреляцияны талдау 2-суретте көрсетілген. S9. Түс, әртүрлі түрлері; үшбұрыш, W + OSS1; тіктөртбұрыш, W + OSM; (C) Nicotiana JA және JA-Ile динамикасы OS қоздыру амплитудасына сәйкес рейтингтелген (екі жақты ANOVA және Tukey HSD көптік салыстырудан кейінгі, * P <0,05, ** P <0,01 және * ** W + OS және W + W салыстыру үшін, P <0,001). Шөпқоректі және метил JA (MeJA) модельдеуден кейінгі әрбір түрдің (D) әртүрлілігі мен (E) мамандануының қораптық графигі. Жұлдызша W + OS және W + W немесе ланолин плюс W (Lan + W) немесе Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) және Lan бақылауы (дисперсияның екі жақты талдауы, содан кейін Tukey's HSD post hoc көптік салыстыруы, *P<0.05, **P<0.01 және ***P<0.001) арасындағы айтарлықтай айырмашылықты көрсетеді.
Қос кластер әдісін қолдана отырып, біз 939 MS/MS (S1 деректер файлы) бар 9 модульді анықтадық. Әртүрлі өңдеулермен қайта конфигурацияланған MS/MS құрамы түрлер арасындағы әртүрлі модульдер арасында айтарлықтай өзгереді (S8 сурет). Hj (мұнда түр деңгейіндегі γ-әртүрлілік деп аталады) және δj-ді визуализациялау әртүрлі түрлердің метаболикалық кеңістікте өте әртүрлі топтарға бірігетінін көрсетеді, мұнда түр деңгейіндегі бөліну әдетте қоздыруға қарағанда айқынырақ болады. N. linear және N. obliquus қоспағанда, олар индукциялық әсерлердің кең динамикалық диапазонын көрсетеді (5B сурет). Керісінше, N. purpurea және N. obtusifolia сияқты түрлер емдеуге метаболикалық реакциясы онша айқын емес, бірақ метаболом әртүрлі. Индукцияланған метаболикалық реакцияның түрге тән таралуы мамандану мен гамма әртүрлілігі арасында айтарлықтай теріс корреляцияға әкелді (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8). JA деңгейлеріндегі OS тудырған өзгерістер метаболомның мамандануымен оң корреляцияланған және әр түр көрсететін метаболикалық гамма әртүрлілігімен теріс корреляцияланған (5B сурет және S9 сурет). 5C суретте «сигналға жауап» түрлері деп аталатын түрлер, мысалы, Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acut және Nepenthes әлсіреген түрлері 30 минутта айтарлықтай белгілер тудырғанын атап өткен жөн. Жақында OS-ға тән JA және JA-Ile өршуі, ал Nepenthes mills, Nepenthes powdery және N. obtusifolia сияқты «сигналға жауап бермейтін» деп аталатын басқа бактериялар тек JA-Ile Edge индукциясын OS ерекшелігінсіз көрсетеді (5C сурет). Метаболикалық деңгейде, жоғарыда айтылғандай, әлсіреген Nepenthes үшін сигналға жауап беретін заттар OS ерекшелігін көрсетті және δj айтарлықтай арттырды, ал Hj төмендеді. Бұл ОС-ға тән прайминг әсері сигналға реактивті емес түрлер ретінде жіктелген түрлерде анықталмады (5-сурет, D және E). ОС-ға тән метаболиттер сигналға жауап беретін түрлер арасында жиірек бөлінеді, және бұл сигналдар әлсіз сигналдық жауаптары бар түрлермен топтастырылады, ал әлсіз сигналдық жауаптары бар түрлер аз өзара тәуелділікті көрсетеді (S8-сурет). Бұл нәтиже ОС-ға тән JA индукциясы мен төменгі ағыс метаболомының ОС-ға тән қайта конфигурациясы түр деңгейінде байланысты екенін көрсетеді.
Әрі қарай, біз өсімдіктерді емдеу үшін метил JA (MeJA) бар ланолин пастасын қолдандық, бұл байланыс режимдері өсімдіктер цитоплазмасында болатын экзогенді JA қолданатын JA қолжетімділігімен шектеле ме, жоқ па, соны зерттедік. Жылдам деэстерификация - JA. Біз JA үздіксіз берілуінен туындаған сигналға жауап беретін түрлерден сигналға жауап бермейтін түрлерге біртіндеп ауысудың бірдей үрдісін анықтадық (5-сурет, D және E). Қысқасы, MeJA емдеу сызықтық нематодтардың, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens және N. mikimotoi метаболомдарын қатты қайта бағдарламалады, нәтижесінде δj айтарлықтай артып, Hj азайды. N. purpurea тек δj артуын көрсетті, бірақ Hj артпады. Бұрын JA деңгейінің өте төмен екенін көрсеткен N. obtusifolia метаболомды қайта конфигурациялау тұрғысынан MeJA емдеуге нашар жауап береді. Бұл нәтижелер сигналға жауап бермейтін түрлерде JA өндірісі немесе сигнал трансдукциясы физиологиялық тұрғыдан шектелгенін көрсетеді. Бұл гипотезаны тексеру үшін біз W + W, W + OSM және W + OSS1 транскриптомымен индукцияланған төрт түрді (N. pallens, N. mills, N. pink және N. microphylla) зерттедік (39). Метаболоманың қайта құрылу үлгісіне сәйкес, түрлер транскриптом кеңістігінде жақсы бөлінген, олардың арасында әлсіреген N. OS индукцияланған RDPI ең жоғары көрсеткішін көрсетті, ал N. gracilis ең төменгі көрсеткішке ие болды (6A сурет). Дегенмен, N. oblonga индукцияланған транскриптом әртүрлілігі төрт түрдің ішінде ең төменгі көрсеткіш екені анықталды, бұл бұрын жеті түрде көрсетілген N. oblonga-ның ең жоғары метабономиялық әртүрлілігіне қайшы келеді. Алдыңғы зерттеулер JA сигналдарын қоса алғанда, ерте қорғаныс сигналдарына қатысты гендер жиынтығы Nicotiana түрлерінде шөпқоректілерге байланысты қоздырғыштармен индукцияланған ерте қорғаныс реакцияларының ерекшелігін түсіндіретінін көрсетті (39). Осы төрт түр арасындағы JA сигнал беру жолдарын салыстыру қызықты заңдылықты анықтады (6B сурет). Бұл жолдағы гендердің көпшілігі, мысалы, AOC, OPR3, ACX және COI1, осы төрт түрде индукцияның салыстырмалы түрде жоғары деңгейін көрсетті. Дегенмен, негізгі ген, JAR4, JA-ны JA-Ile жинақталған транскрипттерінің биологиялық белсенді түріне айналдырады және оның транскрипция деңгейі өте төмен, әсіресе N. mills, Nepenthes pieris және N. microphylla-да. Сонымен қатар, N. bifidum-да тек басқа AOS генінің транскрипті анықталмады. Ген экспрессиясындағы бұл өзгерістер сигналдық-аллергиялық түрлердегі JA өндірісінің төмендігі және N. gracilis индукциясы тудыратын экстремалды фенотиптерге жауапты болуы мүмкін.
(A) Шөпқоректі индукциядан кейін 30 минуттан кейін алынған төрт тығыз байланысты темекі түрінің ерте транскрипциялық жауаптарын қайта бағдарламалаудың ақпараттық теориялық талдауы. RDPI шөпқоректі OS индукциялаған жапырақтарды жара бақылауымен салыстыру арқылы есептеледі. Түстер әртүрлі түрлерді, ал таңбалар әртүрлі емдеу әдістерін көрсетеді. (B) Төрт түр арасындағы JA сигнал беру жолдарындағы ген экспрессиясын талдау. Жеңілдетілген JA жолы қорап диаграммасының жанында көрсетілген. Әртүрлі түстер әртүрлі өңдеу әдістерін көрсетеді. Жұлдызша W + OS емдеуі мен W + W бақылауы арасында айтарлықтай айырмашылық бар екенін көрсетеді (жұптық айырмашылықтар үшін Стьюденттің t-тесті үшін, *P<0.05, **P<0.01 және ***P<0.001). OPDA, 12-оксофитодиен қышқылы; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентенил)-циклопентан-1-октан қышқылы.
Соңғы бөлімде біз әртүрлі өсімдік түрлерінің метаболомының жәндіктер түріне тән қайта құрылуының шөпқоректілерге қалай төзімді болуы мүмкін екенін зерттедік. Алдыңғы зерттеулер Nicotiana туысына баса назар аударды. Олардың Ms және дернәсілдерге төзімділігі айтарлықтай ерекшеленеді (40). Мұнда біз бұл модель мен олардың метаболикалық пластикалығы арасындағы байланысты зерттедік. Жоғарыда келтірілген төрт темекі түрін пайдаланып және шөпқоректілер тудыратын метаболоманың әртүрлілігі мен мамандануы мен өсімдіктердің Ms және Sl-ге төзімділігі арасындағы корреляцияны тексере отырып, біз жалпы Sl All-ге төзімділіктің, әртүрліліктің және маманданудың оң корреляцияланғанын анықтадық, ал сарапшы ханымдарға төзімділік пен мамандану арасындағы корреляция әлсіз және әртүрлілікпен корреляция маңызды емес (S10 сурет). S1 төзімділігіне келетін болсақ, бұрын JA сигналының трансдукция деңгейлерін де, метаболомның пластикасын да көрсететіні көрсетілген әлсіреген N. chinensis және N. gracilis шөпқоректілердің индукциясына айтарлықтай әртүрлі жауап берді және олар да ұқсас жоғары төзімділік көрсетті. Жынысы.
Соңғы алпыс жылда өсімдіктерді қорғау теориясы зерттеушілер өсімдікке мамандандырылған метаболиттердің эволюциясы мен функцияларының айтарлықтай санын болжаған теориялық негізді ұсынды. Бұл теориялардың көпшілігі күшті қорытындылардың қалыпты процедурасын ұстанбайды (41). Олар негізгі болжамдарды (3) бірдей талдау деңгейінде ұсынады. Негізгі болжамдарды тексеру нақты теорияларды талдауға мүмкіндік берген кезде, бұл алға жылжуға мүмкіндік береді. Қолдау көрсетіңіз, бірақ басқаларын қабылдамаңыз (42). Оның орнына, жаңа теория әртүрлі талдау деңгейлерінде болжамдар жасайды және сипаттамалық ойлардың жаңа қабатын қосады (42). Дегенмен, функционалдық деңгейде ұсынылған екі теорияны, MT және OD, шөпқоректілер тудыратын мамандандырылған метаболикалық өзгерістердің маңызды болжамдары ретінде оңай түсіндіруге болады: OD теориясы мамандандырылған метаболикалық «кеңістіктегі» өзгерістер жоғары бағытта болады деп санайды. MT теориясы бұл өзгерістер бағытталмаған және метаболикалық кеңістікте кездейсоқ орналасады және жоғары қорғаныс құндылығы бар метаболиттерге ие болады деп санайды. OD және MT болжамдарының бұрынғы зерттеулері априорлық «қорғаныс» қосылыстарының тар жиынтығын пайдаланып тексерілді. Бұл метаболитке бағытталған сынақтар шөпқоректілік кезінде метаболомды қайта конфигурациялаудың дәрежесі мен траекториясын талдау мүмкіндігін болдырмайды және өсімдік метаболомасында өзгерістерді сандық бағалау ретінде қарастыруға болатын негізгі болжамдарды талап ететін тұрақты статистикалық шеңберде тестілеуге мүмкіндік бермейді. Мұнда біз есептеу MS негізінде метаболомикадағы инновациялық технологияны қолдандық және жаһандық метаболомика деңгейінде ұсынылған екеуінің арасындағы айырмашылықты тексеру үшін ақпараттық теория дескрипторларының жалпы валютасында деконволюциялық MS талдауын жүргіздік. Бұл теорияның негізгі болжамы. Ақпарат теориясы көптеген салаларда, әсіресе биоәртүрлілік пен қоректік заттар ағынын зерттеу контексінде қолданылды (43). Дегенмен, біз білетіндей, бұл өсімдіктердің метаболикалық ақпараттық кеңістігін сипаттау және қоршаған ортаның белгілеріне жауап ретінде уақытша метаболикалық өзгерістерге байланысты экологиялық мәселелерді шешу үшін қолданылатын алғашқы қолданба. Атап айтқанда, бұл әдістің мүмкіндігі өсімдік түрлерінің ішіндегі және арасындағы үлгілерді салыстыру, шөпқоректілердің эволюцияның әртүрлі деңгейлерінде әртүрлі түрлерден түраралық макроэволюциялық үлгілерге қалай эволюцияланғанын зерттеу мүмкіндігінде жатыр. Метаболизм.
Негізгі компоненттік талдау (ПКТ) көп айнымалы деректер жиынтығын өлшемділікті азайту кеңістігіне түрлендіреді, осылайша деректердің негізгі үрдісі түсіндіріледі, сондықтан ол әдетте деректер жиынтығын талдау үшін барлау әдісі ретінде қолданылады, мысалы, деконволюция метаболомы. Дегенмен, өлшемділікті азайту деректер жиынтығындағы ақпарат мазмұнының бір бөлігін жоғалтады, ал ПКТ экологиялық теорияға ерекше қатысты сипаттамалар туралы сандық ақпарат бере алмайды, мысалы: шөпқоректілер мамандандырылған салалардағы әртүрлілікті қалай қайта конфигурациялайды (мысалы, байлық, таралу) және молшылық) метаболиттер? Қандай метаболиттер берілген шөпқоректінің индукцияланған күйінің болжаушылары болып табылады? Ерекшелік, әртүрлілік және индуктивтілік тұрғысынан жапыраққа тән метаболит профилінің ақпарат мазмұны ыдырайды және шөпқоректілерді жеу белгілі бір метаболизмді белсендіре алатыны анықталды. Күтпеген жерден, біз енгізілген ақпараттық теория индикаторларында сипатталғандай, екі шөпқоректі жануардың (түнде тамақтандырылатын генералист Sl) және Solanaceae сарапшысы Ms шабуылдарынан кейін пайда болған метаболикалық жағдайдың үлкен қабаттасуын байқадық. Дегенмен, олардың тамақтану мінез-құлқы мен концентрациясы айтарлықтай ерекшеленеді. OS-тегі май қышқылы-аминқышқылы конъюгаты (FAC) инициаторы (31). Стандартталған тесілген жараларды емдеу үшін шөпқоректі OS қолдану арқылы модельденген шөпқоректі емдеу де ұқсас үрдісті көрсетті. Өсімдіктердің шөпқоректі шабуылдарға реакциясын модельдеудің бұл стандартталған процедурасы шөпқоректілердің тамақтану мінез-құлқындағы өзгерістерден туындаған шатастырушы факторларды жояды, бұл әр түрлі уақытта әртүрлі дәрежедегі зақымға әкеледі (34). OSM-нің негізгі себебі ретінде белгілі FAC OSS1-дегі JAS және басқа өсімдік гормондарының реакцияларын азайтады, ал OSS1 жүздеген есе азайтады (31). Дегенмен, OSS1 OSM-мен салыстырғанда JA жинақталуының ұқсас деңгейін тудырды. Бұрын әлсіреген Непентестегі JA реакциясы OSM-ге өте сезімтал екені көрсетілген, мұнда FAC сумен 1:1000 сұйылтылғанның өзінде өз белсенділігін сақтай алады (44). Сондықтан, OSM-мен салыстырғанда, OSS1-дегі FAC өте төмен болса да, ол JA-ның жеткілікті өршуін тудыруға жеткілікті. Алдыңғы зерттеулер порин тәрізді ақуыздарды (45) және олигосахаридтерді (46) OSS1-де өсімдіктердің қорғаныс реакцияларын іске қосу үшін молекулалық белгілер ретінде пайдалануға болатынын көрсетті. Дегенмен, OSS1-дегі бұл қоздырғыштар қазіргі зерттеуде байқалған JA жиналуына жауапты ма, жоқ па, әлі белгісіз.
Әртүрлі шөпқоректілерді немесе экзогенді JA немесе SA (салицил қышқылын) қолданудан туындаған дифференциалды метаболикалық саусақ іздерін сипаттайтын зерттеулер аз болғанымен (47), өсімдік шөптер желісіндегі шөпқоректілер түріне тән бұзылуды және оның жеке ақпаратқа әсерін ешкім бұзған жоқ. Метаболизмнің жалпы әсері жүйелі түрде зерттеледі. Бұл талдау JA-дан басқа өсімдік гормондарымен ішкі гормондық желі байланысы шөпқоректілер тудырған метаболикалық қайта құрудың ерекшелігін қалыптастыратынын растады. Атап айтқанда, біз OSM тудырған ET OSS1 тудырған ET-ден айтарлықтай жоғары екенін анықтадық. Бұл режим OSM-дегі FAC мөлшерінің көп болуымен сәйкес келеді, бұл ET жарылысын іске қосу үшін қажетті және жеткілікті шарт болып табылады (48). Өсімдіктер мен шөпқоректілер арасындағы өзара әрекеттесу контексінде ET-нің өсімдікке тән метаболит динамикасына сигнал беру функциясы әлі де сирек кездеседі және тек бір қосылыс тобына бағытталған. Сонымен қатар, көптеген зерттеулер ЭТ реттелуін зерттеу үшін ЭТ немесе оның прекурсорларын немесе әртүрлі ингибиторларды экзогендік қолдануды пайдаланды, олардың арасында бұл экзогендік химиялық қолдану көптеген спецификалық емес жанама әсерлерді тудырады. Біздің білуімізше, бұл зерттеу өсімдік метаболомының динамикасын үйлестіру үшін бұзылған трансгендік өсімдіктерді өндіру және қабылдау үшін ЭТ пайдаланудағы ЭТ рөлін алғашқы кең ауқымды жүйелі зерттеу болып табылады. Шөпқоректілерге тән ЭТ индукциясы ақырында метаболомалық реакцияны модуляциялай алады. Ең маңыздысы - феноламидтердің шөпқоректілерге тән de novo жинақталуын анықтаған ЭТ биосинтезінің (ACO) және қабылдау (ETR1) гендерінің трансгендік манипуляциясы. Бұрын ЭТ путресцин N-метилтрансферазасын реттеу арқылы JA индукцияланған никотиннің жинақталуын дәл реттей алатыны көрсетілген (49). Дегенмен, механикалық тұрғыдан алғанда, ЭТ фенамидтің индукциясын қалай дәл реттейтіні белгісіз. ЭТ сигналының трансдукция функциясынан басқа, метаболикалық ағынды полиаминофенол амидтеріне инвестицияны реттеу үшін S-аденозил-1-метионинге де бағыттауға болады. S-аденозил-1-метионин ЭТ және полиамин биосинтетикалық жолының жалпы аралық өнімі болып табылады. ЭТ сигналының феноламид деңгейін реттейтін механизмін одан әрі зерттеу қажет.
Ұзақ уақыт бойы белгісіз құрылымды арнайы метаболиттердің көптігіне байланысты, нақты метаболикалық санаттарға қатты назар аудару биологиялық өзара әрекеттесуден кейін метаболикалық әртүрліліктің уақытша өзгерістерін қатаң бағалауға мүмкіндік бермеді. Қазіргі уақытта, ақпараттық теорияны талдау негізінде, бейтарап метаболиттерге негізделген MS/MS спектрін алудың негізгі нәтижесі - шөпқоректілерді жейтін немесе имитациялайтын шөпқоректілер жапырақ метаболомасының жалпы метаболикалық әртүрлілігін төмендете береді, сонымен бірге оның мамандану дәрежесін арттырады. Шөпқоректілерден туындаған метаболоманың ерекшелігінің бұл уақытша өсуі транскриптомның ерекшелігінің синергетикалық жоғарылауымен байланысты. Бұл үлкен метаболоманың мамандануына ең көп үлес қосатын ерекшелік (Si мәні жоғары) - бұрын сипатталған шөпқоректі функциясы бар арнайы метаболит. Бұл модель OD теориясын болжауға сәйкес келеді, бірақ метаболоманы қайта бағдарламалаудың кездейсоқтығына байланысты MT болжамы сәйкес келмейді. Дегенмен, бұл деректер аралас модельді болжауға да сәйкес келеді (ең жақсы MT; 1B сурет), себебі белгісіз қорғаныс функциялары бар басқа сипатталмаған метаболиттер әлі де кездейсоқ Si таралуын ұстануы мүмкін.
Бұл зерттеуде айқын көрінетін ерекше үлгі - микроэволюция деңгейінен (бір өсімдік және темекі популяциясы) үлкен эволюциялық масштабқа дейін (тығыз байланысты темекі түрлері) эволюциялық ұйымдасудың әртүрлі деңгейлері «ең жақсы қорғаныста» болады. Шөпқоректілердің қабілеттерінде айтарлықтай айырмашылықтар бар. Мур және т.б. (20) және Кесслер мен Калске (1) Уиттакер (50) бастапқыда ерекшелеген биоәртүрліліктің үш функционалдық деңгейін химиялық әртүрліліктің конститутивті және индукцияланған уақытша өзгерістеріне түрлендіруді тәуелсіз түрде ұсынды; бұл авторлар да қорытындылаған жоқ. Ірі көлемді метаболомдық деректерді жинау процедуралары да осы деректерден метаболикалық әртүрлілікті қалай есептеу керектігін көрсетпейді. Бұл зерттеуде Уиттакердің функционалдық жіктелуіне шамалы түзетулер α-метаболикалық әртүрлілікті берілген өсімдіктегі MS/MS спектрлерінің әртүрлілігі ретінде, ал β-метаболикалық әртүрлілікті популяциялар тобының негізгі ішкі түраралық метаболизмі ретінде қарастырады. Кеңістік және γ-метаболикалық әртүрлілік ұқсас түрлерді талдаудың жалғасы болады.
JA сигналы шөпқоректі жануарлардың метаболикалық реакцияларының кең ауқымы үшін өте маңызды. Дегенмен, JA биосинтезінің метаболомдық әртүрлілікке түрішілік реттелуінің үлесін қатаң сандық тексеру жеткіліксіз және JA сигналы жоғары макроэволюциялық шкала бойынша стресс тудыратын метаболикалық диверсификацияның жалпы орны болып табылатынын анықтау әлі де қиын. Біз Nepenthes шөпқоректісінің шөпқоректі табиғаты метаболомдық мамандануды тудыратынын және Nicotiana түрлерінің популяциясында және тығыз байланысты Nicotiana түрлері арасында метаболомдық маманданудың өзгеруі JA сигнализациясымен жүйелі түрде оң корреляцияланғанын байқадық. Сонымен қатар, JA сигналы бұзылған кезде, бір генотипті шөпқоректі жануар тудыратын метаболикалық ерекшелік жойылады (3-сурет, C және E). Табиғи түрде әлсіреген Nepenthes популяцияларының метаболикалық спектр өзгерістері негізінен сандық болғандықтан, бұл талдаудағы метаболикалық β әртүрлілігі мен ерекшелігінің өзгерістері негізінен метаболиттерге бай қосылыс санаттарының күшті қозуынан туындауы мүмкін. Бұл қосылыс кластары метаболомдық профильдің бір бөлігінде басым және JA сигналдарымен оң корреляцияға әкеледі.
Темекі түрлерінің биохимиялық механизмдері өте әртүрлі болғандықтан, метаболиттер сапалық тұрғыдан нақты анықталады, сондықтан ол аналитикалық сипатта болады. Ақпарат теориясының алынған метаболикалық профильді өңдеуі шөпқоректі индукция метаболикалық гамма әртүрлілігі мен мамандану арасындағы ымыраға келуді күшейтетінін көрсетеді. JA сигналы бұл ымыраға келуде орталық рөл атқарады. Метаболомалық маманданудың артуы негізгі OD болжамына сәйкес келеді және JA сигналымен оң корреляцияланады, ал JA сигналы метаболикалық гамма әртүрлілігімен теріс корреляцияланады. Бұл модельдер өсімдіктердің OD қабілеті негізінен JA пластикалығымен анықталатынын көрсетеді, микроэволюциялық масштабта немесе үлкен эволюциялық масштабта болсын. JA биосинтезі ақауларын айналып өтетін экзогендік JA қолдану эксперименттері тығыз байланысты темекі түрлерін шөпқоректілер тудыратын JA режимі мен метаболомалық пластика сияқты сигналға жауап беретін және сигналға жауап бермейтін түрлерге бөлуге болатынын көрсетеді. Сигналға жауап бермейтін түрлер эндогендік JA өндіре алмауына байланысты жауап бере алмайды және сондықтан физиологиялық шектеулерге ұшырайды. Бұл JA сигнал беру жолындағы кейбір негізгі гендердегі (N. crescens-тегі AOS және JAR4) мутациялардан туындауы мүмкін. Бұл нәтиже осы түраралық макроэволюциялық үлгілердің негізінен ішкі гормондарды қабылдау мен жауап берудегі өзгерістермен байланысты болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Өсімдіктер мен шөпқоректілер арасындағы өзара әрекеттесуден басқа, метаболикалық әртүрлілікті зерттеу қоршаған ортаға биологиялық бейімделуді және күрделі фенотиптік белгілердің эволюциясын зерттеудегі барлық маңызды теориялық жетістіктермен байланысты. Заманауи MS құралдарымен алынған деректер көлемінің артуымен метаболикалық әртүрлілік туралы гипотезаны тексеру енді жеке/санаттағы метаболиттердің айырмашылықтарынан асып түсіп, күтпеген заңдылықтарды анықтау үшін жаһандық талдау жүргізе алады. Кең ауқымды талдау процесінде маңызды метафора - деректерді зерттеу үшін пайдалануға болатын мағыналы карталарды ойлап табу идеясы. Сондықтан, бейтарап MS/MS метаболомикасы мен ақпарат теориясының қазіргі үйлесімінің маңызды нәтижесі - ол әртүрлі таксономиялық масштабтардағы метаболикалық әртүрлілікті шолу үшін карталар құру үшін пайдалануға болатын қарапайым метриканы ұсынады. Бұл әдістің негізгі талабы. Микро/макро эволюцияны және қауымдастық экологиясын зерттеу.
Макроэволюциялық деңгейде Эрлих пен Рейвеннің (51) өсімдік-жәндік бірлескен эволюция теориясының негізі түраралық метаболикалық әртүрліліктің өзгеруі өсімдік тектерінің әртараптануының себебі болып табылады деп болжау болып табылады. Дегенмен, осы маңызды жұмыстың жариялануынан бергі елу жыл ішінде бұл гипотеза сирек тексерілді (52). Бұл көбінесе алыс қашықтықтағы өсімдік тектеріндегі салыстырмалы метаболикалық сипаттамалардың филогенетикалық сипаттамаларына байланысты. Сирек кездесетіндік мақсатты талдау әдістерін бекіту үшін пайдаланылуы мүмкін. Ақпараттық теориямен өңделген қазіргі MS/MS жұмыс процесі белгісіз метаболиттердің MS/MS құрылымдық ұқсастығын сандық түрде анықтайды (алдын ала метаболиттерді таңдамай) және бұл MS/MS-терді MS/MS жиынтығына айналдырады, осылайша кәсіби метаболизмде Бұл макроэволюциялық модельдер жіктеу шкаласы бойынша салыстырылады. Қарапайым статистикалық көрсеткіштер. Процесс филогенетикалық талдауға ұқсас, ол алдын ала болжамсыз әртараптану жылдамдығын немесе сипат эволюциясын сандық түрде анықтау үшін тізбекті туралауды қолдана алады.
Биохимиялық деңгейде Фирн мен Джонстың (53) скринингтік гипотезасы бұрын байланыссыз немесе алмастырылған метаболиттердің биологиялық белсенділігін жүзеге асыру үшін шикізатпен қамтамасыз ету үшін метаболикалық әртүрліліктің әртүрлі деңгейлерде сақталатынын көрсетеді. Ақпараттық теория әдістері метаболиттердің мамандануы кезінде пайда болатын осы метаболитке тән эволюциялық ауысуларды ұсынылған эволюциялық скрининг процесінің бөлігі ретінде сандық бағалауға болатын негізді қамтамасыз етеді: төмен ерекшеліктен жоғары ерекшелікке дейінгі биологиялық белсенді бейімделу Берілген ортаның тежелген метаболиттері.
Жалпы алғанда, молекулалық биологияның алғашқы кезеңдерінде өсімдіктерді қорғаудың маңызды теориялары жасалды, ал дедуктивті гипотезаға негізделген әдістер ғылыми прогрестің жалғыз құралы болып саналады. Бұл көбінесе бүкіл метаболомды өлшеудің техникалық шектеулеріне байланысты. Гипотезаға негізделген әдістер басқа себептік механизмдерді таңдауда әсіресе пайдалы болғанымен, олардың биохимиялық желілерді түсінуімізді алға жылжыту мүмкіндігі қазіргі заманғы деректерді көп қажет ететін ғылымда қазіргі уақытта қолжетімді есептеу әдістеріне қарағанда шектеулі. Сондықтан болжау мүмкін емес теориялар қолжетімді деректердің ауқымынан әлдеқайда асып түседі, сондықтан зерттеу саласындағы прогрестің гипотетикалық формуласын/сынақ циклін жою мүмкін емес (4). Біз мұнда енгізілген метаболомиканың есептеу жұмыс процесі метаболикалық әртүрліліктің соңғы (қалай) және соңғы (неге) мәселелеріне қызығушылықты қайта оята алатынын және теориялық тұрғыдан басқарылатын деректер ғылымының жаңа дәуіріне үлес қоса алатынын болжаймыз. Бұл дәуір алдыңғы ұрпақтарға шабыт берген маңызды теорияларды қайта қарастырды.
Шөпқоректілерді тікелей қоректендіру бір раушан гүлдейтін өсімдіктің бозғылт түсті құмыра жапырағында екінші жас дернәсілін немесе Sl дернәсілін өсіру арқылы жүзеге асырылады, әр өсімдікте 10 өсімдік қайталанады. Жәндіктердің дернәсілдері қысқыштармен қысылып, қалған жапырақ тіндері инфекциядан кейін 24 және 72 сағаттан кейін жиналып, тез мұздатылған, ал метаболиттер экстракцияланған.
Шөпқоректілерді емдеуді жоғары синхрондалған түрде модельдеу. Әдіс мата өрнек дөңгелектерін пайдаланып, мата гирляндасының өсу кезеңінде өсімдіктің үш толық жайылған жапырағының ортаңғы қабырғасының екі жағындағы үш қатар тікенекті тесіп, дереу 1:5 сұйылтылған Ms жағудан тұрады. Немесе қолғап киген саусақтарды пайдаланып, тесілген жараға S1 OS енгізіңіз. Жоғарыда сипатталғандай жапырақты жинап, өңдеңіз. Бастапқы метаболиттер мен өсімдік гормондарын алу үшін бұрын сипатталған әдісті қолданыңыз (54).
Экзогенді JA қолдану үшін әр түрдің алты раушан гүлдейтін өсімдіктерінің әрқайсысының үш жапырақшасы 150 мкг MeJA (Lan + MeJA) бар 20 мкл ланолин пастасымен және 20 мкл ланолинмен және жараны емдеумен (Lan + W) өңделеді немесе бақылау ретінде 20 мкл таза ланолин қолданылады. Жапырақтары өңдеуден кейін 72 сағаттан кейін жиналып, сұйық азотта мұздатылған күйінде сақталып, пайдаланылғанға дейін -80°C температурада сақталады.
Біздің зерттеу тобымызда төрт JA және ET трансгендік желілері, атап айтқанда irAOC (36), irCOI1 (55), irACO және sETR1 (48) анықталды. irAOC JA және JA-Ile деңгейлерінің айтарлықтай төмендегенін көрсетті, ал irCOI1 JA-ларға сезімтал болмады. EV-мен салыстырғанда JA-Ile жинақталуы артты. Сол сияқты, irACO ET өндірісін азайтады, ал EV-мен салыстырғанда ET-ге сезімтал емес sETR1 ET өндірісін арттырады.
Фотоакустикалық лазерлік спектрометр (Sensor Sense ETD-300 нақты уақыттағы ET сенсоры) ET өлшеуін инвазивті емес түрде жүргізу үшін қолданылады. Өңдеуден кейін бірден жапырақтардың жартысы кесіліп, 4 мл тығыздалған шыны құтыға салынды, ал бас кеңістігі 5 сағат ішінде жиналды. Өлшеу кезінде әрбір құты 8 минут бойы сағатына 2 литр таза ауа ағынымен шайылды, ол бұрын Sensor Sense ұсынған катализатор арқылы CO2 мен суды кетіру үшін өтті.
Микрочип деректері бастапқыда (35)-те жарияланған және Ұлттық биотехнологиялық ақпарат орталығының (NCBI) ген экспрессиясының кешенді дерекқорында (кіру нөмірі GSE30287) сақталған. Бұл зерттеу үшін W + OSM өңдеуінен туындаған жапырақтарға және зақымдалмаған бақылауға сәйкес келетін деректер алынды. Шикі қарқындылық log2. Статистикалық талдау алдында бастапқы мән R бағдарламалық пакетін пайдаланып түрлендіріліп, 75-ші перцентильге дейін қалыпқа келтірілді.
Nicotiana түрлерінің бастапқы РНҚ секвенирлеу (РНҚ-секвенирлеу) деректері NCBI қысқа оқу мұрағатынан (SRA) алынды, жоба нөмірі PRJNA301787, оны Чжоу және т.б. (39) хабарлады және (56)-да сипатталғандай жалғасады. Nicotiana түрлеріне сәйкес келетін W + W, W + OSM және W + OSS1 арқылы өңделген шикі деректер осы зерттеуде талдау үшін таңдалды және келесідей өңделді: Біріншіден, шикі РНҚ-секвенирлеу көрсеткіштері FASTQ форматына түрлендірілді. HISAT2 FASTQ-ны SAM-ға түрлендіреді, ал SAMtools SAM файлдарын сұрыпталған BAM файлдарына түрлендіреді. StringTie ген экспрессиясын есептеу үшін қолданылады және оның экспрессия әдісі - миллион секвенирленген транскрипция фрагменттеріне мың негізгі фрагментке фрагменттер келеді.
Талдау кезінде пайдаланылған Acclaim хроматографиялық бағанасы (150 мм x 2,1 мм; бөлшектердің өлшемі 2,2 мкм) және 4 мм x 4 мм қорғаныс бағанасы бірдей материалдан тұрады. Dionex UltiMate 3000 ультра жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясы (UHPLC) жүйесінде келесі екілік градиент қолданылады: 0-ден 0,5 минутқа дейін, изократиялық 90% A [деиондалған су, 0,1% (көлем/көлем) ацетонитрил және 0,05% құмырсқа қышқылы], 10% B (ацетонитрил және 0,05% құмырсқа қышқылы); 0,5-тен 23,5 минутқа дейін, градиент фазасы сәйкесінше 10% A және 90% B; 23,5-тен 25 минутқа дейін, изократиялық 10% A және 90% B. Ағын жылдамдығы 400 мкл/мин. Барлық MS талдаулары үшін баған элюентін оң иондану режимінде жұмыс істейтін электроспрей көзімен жабдықталған квадрупольді және ұшу уақытын (qTOF) анализаторға енгізіңіз (капиллярлық кернеу, 4500 В; капиллярлық шығыс 130 В; кептіру температурасы 200°C; кептіру ауа ағыны 10 литр/мин).
Жалпы анықталатын метаболикалық профиль туралы құрылымдық ақпарат алу үшін деректерден маңызды емес немесе ажыратылмайтын MS / MS фрагменттерін талдау (бұдан әрі MS / MS деп аталады) жүргізіңіз. Таңдамайтын MS/MS әдісінің тұжырымдамасы квадрупольдің массалық оқшаулау терезесі өте үлкен екеніне негізделген [сондықтан барлық масса-заряд қатынасы (m/z) сигналдарын фрагменттер деп қарастырыңыз]. Осы себепті, Impact II құралы CE көлбеуін жасай алмағандықтан, соқтығысудан туындаған диссоциациялану соқтығысу энергиясының (CE) мәндерінің жоғарылауын пайдаланып бірнеше тәуелсіз талдаулар жүргізілді. Қысқаша айтқанда, алдымен үлгіні UHPLC-электроспрей иондалуы/qTOF-MS арқылы бір массалық спектрометрия режимін (көз ішіндегі фрагментация арқылы пайда болатын төмен фрагментация жағдайлары) пайдаланып, m/z 50-ден 1500-ге дейін 5 Гц қайталау жиілігінде сканерлеп талдаңыз. MS/MS талдауы үшін соқтығысу газы ретінде азотты пайдаланыңыз және келесі төрт түрлі соқтығысудан туындаған диссоциация кернеулерінде тәуелсіз өлшеулер жүргізіңіз: 20, 30, 40 және 50 эВ. Өлшеу процесінде квадрупольдің массалық оқшаулау терезесі ең үлкен, м/з 50-ден 1500-ге дейін. Алдыңғы корпус м/з және оқшаулау ені эксперименті 200-ге орнатылған кезде, масса диапазоны құралдың жұмыс бағдарламалық жасақтамасы және 0 Da арқылы автоматты түрде іске қосылады. Бір массалық режимдегідей массалық фрагменттерді сканерлеңіз. Массаны калибрлеу үшін натрий форматын (50 мл изопропанол, 200 мкл құмырсқа қышқылы және 1 мл 1M NaOH сулы ерітіндісі) пайдаланыңыз. Bruker жоғары дәлдіктегі калибрлеу алгоритмін пайдаланып, деректер файлы берілген уақыт аралығында орташа спектрді іске қосқаннан кейін калибрленеді. Шикі деректер файлдарын NetCDF форматына түрлендіру үшін Data Analysis v4.0 бағдарламалық жасақтамасының (Brook Dalton, Бремен, Германия) экспорттау функциясын пайдаланыңыз. MS/MS деректер жиынтығы MetaboLights (www.ebi.ac.uk) ашық метаболомика дерекқорында кіру нөмірімен сақталды. MTBLS1471.
MS/MS құрастыруын төмен және жоғары соқтығысу энергиясы мен жаңадан енгізілген ережелер үшін MS1 және MS/MS сапа сигналдары арасындағы корреляциялық талдау арқылы жүзеге асыруға болады. R скрипті өнімге прекурсордың таралуының корреляциялық талдауын жүзеге асыру үшін, ал ережелерді жүзеге асыру үшін C# скрипті (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) қолданылады.
Фондық шуылдан туындаған жалған оң қателерді және тек бірнеше үлгіде белгілі бір m/z ерекшеліктерін анықтаудан туындаған жалған корреляцияны азайту үшін біз R пакетінің XCMS (фондық шуды түзету үшін) «толтырылған шың» функциясын қолданамыз, ол «NA» (анықталмаған шың) қарқындылығын ауыстыру үшін пайдаланылуы керек. Толтыру шыңы функциясы пайдаланылған кезде, деректер жиынында корреляция есептеуіне әсер ететін көптеген «0» қарқындылық мәндері бар. Содан кейін, толтырылған шың функциясы пайдаланылған кезде және толтырылған шың функциясы пайдаланылмаған кезде алынған деректерді өңдеу нәтижелерін салыстырамыз және орташа түзетілген бағаланған мәнге негізделген фондық шу мәнін есептейміз, содан кейін осы 0 қарқындылық мәндерін есептелген фондық мәнмен ауыстырамыз. Сондай-ақ, біз қарқындылығы фондық мәннен үш есе асатын ерекшеліктерді ғана қарастырдық және оларды «шынайы шыңдар» деп санадық. PCC есептеулері үшін тек үлгі прекурсорының (MS1) және кемінде сегіз шынайы шыңы бар фрагменттік деректер жиындарының m/z сигналдары ғана ескеріледі.
Егер бүкіл үлгідегі прекурсорлық сапа белгісінің қарқындылығы төмен немесе жоғары соқтығысу энергиясына ұшыраған сол сапа белгісінің төмендеген қарқындылығымен айтарлықтай корреляцияланса және бұл мүмкіндік CAMERA арқылы изотоп шыңы ретінде белгіленбесе, оны одан әрі анықтауға болады. Содан кейін, 3 секунд ішінде барлық мүмкін прекурсорлық өнім жұптарын есептеу арқылы (шыңдарды сақтау үшін болжамды сақтау уақыты) корреляциялық талдау жүргізіледі. Тек m/z мәні прекурсорлық мәннен төмен болғанда және MS/MS фрагментациясы деректер жиынындағы прекурсормен бірдей үлгі орнында болғанда ғана, ол фрагмент болып саналады.
Осы екі қарапайым ережеге сүйене отырып, біз анықталған прекурсордың m/z мәнінен үлкен m/z мәндері бар көрсетілген фрагменттерді алып тастаймыз және прекурсор мен көрсетілген фрагменттің пайда болатын үлгі орнына сүйенеміз. Сондай-ақ, MS1 режимінде жасалған көптеген бастапқы фрагменттермен жасалған сапа ерекшеліктерін кандидат прекурсорлар ретінде таңдауға болады, осылайша артық MS/MS қосылыстарын жасайды. Бұл деректер артықшылығын азайту үшін, егер спектрлердің NDP ұқсастығы 0,6-дан асса және олар CAMERA-мен түсіндірілген «pcgroup» хроматограммасына жатса, біз оларды біріктіреміз. Соңында, прекурсормен және фрагменттермен байланысты барлық төрт CE нәтижелерін әртүрлі соқтығысу энергияларында бірдей m/z мәні бар барлық кандидат шыңдары арасында ең жоғары қарқындылық шыңын таңдау арқылы соңғы деконволюцияланған композиттік спектрге біріктіреміз. Кейінгі өңдеу қадамдары композиттік спектр тұжырымдамасына негізделген және фрагментация ықтималдығын барынша арттыру үшін қажетті әртүрлі CE шарттарын ескереді, себебі кейбір фрагменттерді тек белгілі бір соқтығысу энергиясы кезінде анықтауға болады.
Метаболикалық профильдің индуктивтілігін есептеу үшін RDPI (30) қолданылды. Метаболикалық спектрдің әртүрлілігі (Hj индексі) Мартинес және т.б. сипаттаған келесі теңдеуді қолдана отырып, MS/MS жиілік таралуының Шеннон энтропиясын қолдана отырып, MS/MS прекурсорларының көптігінен алынады. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) мұндағы Pij j-ші үлгідегі i-ші MS/MS салыстырмалы жиілігіне сәйкес келеді (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Метаболикалық ерекшелік (Si индексі) қарастырылып отырған үлгілер арасындағы жиілікке қатысты берілген MS/MS экспрессиясының сәйкестігі ретінде анықталады. MS/MS ерекшелігі Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) ретінде есептеледі.
Әрбір j үлгісінің метаболомға тән δj индексін және MS/MS ерекшелігінің орташа мәнін өлшеу үшін келесі формуланы пайдаланыңыз: δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS спектрлері жұптасып тураланады, ал ұқсастық екі ұпайға негізделіп есептеледі. Біріншіден, стандартты NDP (косинус корреляциясы әдісі деп те аталады) көмегімен спектрлер арасындағы сегменттік ұқсастықты бағалау үшін келесі теңдеуді пайдаланыңыз: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, мұндағы S1 және S2 Тиісінше, 1-ші спектр және 2-ші спектр үшін, сондай-ақ WS1, i және WS2 үшін i екі спектр арасындағы i-ші ортақ шыңның айырмашылығы 0,01 Da-дан аз болатын шың қарқындылығына негізделген салмақты білдіреді. Салмақ келесідей есептеледі: MassBank ұсынғандай, W = [шың қарқындылығы] m [сапасы] n, m = 0,5, n = 2.
Екінші бағалау әдісі енгізілді, ол MS/MS арасындағы ортақ NL талдауын қамтыды. Осы мақсатта біз MS фрагментация процесінде жиі кездесетін 52 NL тізімін және әлсіреген Nepenthes түрлерінің екінші реттік метаболиттерінің MS/MS спектрі үшін бұрын аннотацияланған нақтырақ NL (S1 деректер файлы) қолдандық (9, 26). Әрбір MS/MS үшін кейбір NL-дің ағымдағы және жоқтығына сәйкес келетін 1 және 0 екілік векторын жасаңыз. Евклидтік қашықтық ұқсастығына сүйене отырып, NL ұқсастық ұпайы екілік NL векторларының әрбір жұбы үшін есептеледі.
Қос кластерлеуді орындау үшін біз салмақталған гендердің бірлескен экспрессиясын талдаудың (WGCNA) кеңейтіміне негізделген DiffCoEx R пакетін қолдандық. MS/MS спектрлерінің NDP және NL скоринг матрицаларын пайдаланып, салыстырмалы корреляция матрицасын есептеу үшін DiffCoEx қолдандық. Екілік кластерлеу «cutreeDynamic» параметрін method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T және minClusterSize = 10 мәндеріне орнату арқылы орындалады. DiffCoEx R бастапқы коды Tesson және т.б. (57) қосымша 1-файлдан жүктелген; Қажетті R WGCNA бағдарламалық пакетін https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA сайтынан табуға болады.
MS/MS молекулалық желілік талдауды жүргізу үшін біз NDP және NL ұқсастық түрлеріне негізделген жұптастырылған спектрлік байланысты есептедік және CyFilescape yFiles орналасу алгоритмі кеңейтім қолданбасында органикалық орналасуды пайдаланып желілік топологияны визуализациялау үшін Cytoscape бағдарламалық жасақтамасын пайдаландық.
Деректер бойынша статистикалық талдау жүргізу үшін R 3.0.1 нұсқасын пайдаланыңыз. Статистикалық маңыздылық екі жақты дисперсиялық талдау (ANOVA) арқылы бағаланды, содан кейін Тукидің шынымен маңызды айырмашылық (HSD) пост-хок сынағы жүргізілді. Шөпқоректілермен емдеу мен бақылау арасындағы айырмашылықты талдау үшін бірдей дисперсиясы бар екі топ үлгілерінің екі жақты таралуы Стьюденттің t сынағы арқылы талданды.
Осы мақалаға қосымша материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1 сайтынан қараңыз.
Бұл Creative Commons Attribution-Non-Commercial лицензиясының шарттары бойынша таратылатын ашық қолжетімді мақала, ол кез келген құралда пайдалануға, таратуға және көбейтуге мүмкіндік береді, егер соңғы пайдалану коммерциялық пайда табу үшін болмаса және түпнұсқа жұмыс дұрыс болса. Сілтеме.
Ескертпе: Біз сізден тек электрондық пошта мекенжайыңызды беруіңізді сұраймыз, сонда сіз парақшаға ұсынған адам сіздің электрондық поштаны көруін қалайтыныңызды және оның спам емес екенін білуі керек. Біз ешқандай электрондық пошта мекенжайларын тіркемейміз.
Бұл сұрақ сіздің келуші екеніңізді тексеру және спамның автоматты түрде жіберілуін болдырмау үшін қолданылады.
Ақпарат теориясы арнайы метаболомдарды салыстыру және сынақтан қорғаныс теорияларын болжау үшін әмбебап валютаны қамтамасыз етеді.
Ақпарат теориясы арнайы метаболомдарды салыстыру және сынақтан қорғаныс теорияларын болжау үшін әмбебап валютаны қамтамасыз етеді.
©2021 Ғылымды дамыту жөніндегі Америка қауымдастығы. барлық құқықтар қорғалған. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef және COUNTER серіктесі болып табылады. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.