Мақала «Бұршақ тұқымдастардың патогендер мен зиянкестерге төзімділігін арттыру» зерттеу тақырыбының бөлігі болып табылады, барлық 5 мақаланы қараңыз.
Саңырауқұлақ өсімдік ауруының некрозының қоздырғышы Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary әртүрлі қожайын өсімдіктерді жұқтыру үшін көп деңгейлі стратегияны қолданады. Бұл зерттеуде Pseudomonas sclerotiorum тудыратын ақ зеңге Phaseolus vulgaris L. молекулалық, физиологиялық және биохимиялық реакцияларын күшейту үшін балама басқару стратегиясы ретінде басқа маңызды аминқышқылдарының синтезін ынталандыратын диамин L-орнитинін қолдану ұсынылады. In vitro тәжірибелер L-орнитиннің S. pyrenoidosa мицелийінің өсуін дозаға тәуелді түрде айтарлықтай тежейтінін көрсетті. Сонымен қатар, ол жылыжай жағдайында ақ зеңнің ауырлығын айтарлықтай төмендетуі мүмкін. Сонымен қатар, L-орнитин өңделген өсімдіктердің өсуін ынталандырды, бұл L-орнитиннің тексерілген концентрациялары өңделген өсімдіктер үшін фитотоксикалық емес екенін көрсетеді. Сонымен қатар, L-орнитин ферменттік емес антиоксиданттардың (жалпы еритін фенолдар мен флавоноидтар) және ферменттік антиоксиданттардың (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) және полифенолоксидаза (PPO)) экспрессиясын күшейтті және антиоксидантпен байланысты үш геннің (PvCAT1, PvSOD және PvGR) экспрессиясын арттырды. Сонымен қатар, кремний анализінде S. sclerotiorum геномында болжамды оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) ақуызының бар екендігі анықталды, ол функционалдық талдау, сақталған домендер және топология тұрғысынан Aspergillus fijiensis (AfOAH) және Penicillium sp. (PlOAH) оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) ақуыздарына өте ұқсас болды. Қызығы, L-орнитинді картоп декстроза сорпасына (PDB) қосу S. sclerotiorum мицелийіндегі SsOAH генінің экспрессиясын айтарлықтай төмендетті. Сол сияқты, L-орнитинді экзогендік қолдану өңделген өсімдіктерден жиналған саңырауқұлақ мицелийлерінде SsOAH генінің экспрессиясын айтарлықтай төмендетті. Соңында, L-орнитинді қолдану PDB ортасында да, жұқтырған жапырақтарда да қымыздық қышқылының бөлінуін айтарлықтай төмендетті. Қорытындылай келе, L-орнитин жұқтырған өсімдіктердің тотығу-тотықсыздану күйін сақтауда, сондай-ақ қорғаныс реакциясын күшейтуде маңызды рөл атқарады. Бұл зерттеудің нәтижелері ақ зеңді бақылаудың инновациялық, экологиялық таза әдістерін әзірлеуге және оның бұршақ өндірісіне және басқа да дақылдарға әсерін азайтуға көмектесуі мүмкін.
Некротрофты саңырауқұлақ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary тудыратын ақ зең - бұл жаһандық бұршақ (Phaseolus vulgaris L.) өндірісіне елеулі қауіп төндіретін жойқын, өнімділікті төмендететін ауру (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum - 600-ден астам өсімдік түрлерінің кең ауқымына ие және иесінің тіндерін спецификалық емес түрде тез мацерациялау қабілетіне ие, бақылауға алу қиын топырақта таралатын саңырауқұлақ өсімдік патогендерінің бірі (Liang and Rollins, 2018). Қолайсыз жағдайларда ол тіршілік циклінің маңызды кезеңін бастан кешіреді, топырақта «склеротия» деп аталатын қара, қатты, тұқым тәрізді құрылымдар немесе жұқтырған өсімдіктердің мицелийінде немесе сабақтарының түбінде ақ, ​​мамық өсінділер ретінде ұзақ уақыт бойы тыныштықта болады (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum склеротия түзуге қабілетті, бұл оған жұқтырған егістіктерде ұзақ уақыт бойы тіршілік етуге және ауру кезінде сақталуға мүмкіндік береді (Schwartz et al., 2005). Склеротиялар қоректік заттарға бай, топырақта ұзақ уақыт сақталуы мүмкін және кейінгі инфекциялар үшін негізгі инокулум ретінде қызмет етеді (Schwartz et al., 2005). Қолайлы жағдайларда склеротиялар өніп, ауада таралатын спораларды түзеді, олар өсімдіктің барлық жер үсті бөліктерін, соның ішінде гүлдерді, сабақтарды немесе бүршіктерді жұқтыруы мүмкін (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum өзінің қожайын өсімдіктерін жұқтыру үшін көп деңгейлі стратегияны қолданады, ол склеротиалды өскіннен бастап симптомдардың дамуына дейінгі бірқатар үйлестірілген оқиғаларды қамтиды. Бастапқыда S. sclerotiorum апотекия деп аталатын саңырауқұлақ тәрізді құрылымдардан аспалы спораларды (аскоспоралар деп аталады) шығарады, олар ауаға еніп, жұқтырған өсімдік қалдықтарында қозғалмайтын склеротияға айналады (Bolton et al., 2006). Содан кейін саңырауқұлақ өсімдік жасуша қабырғасының рН-ын бақылау, ферментативті деградацияны және тіндердің инвазиясын күшейту (Hegedus and Rimmer, 2005) және қожайын өсімдіктің тотығу жарылысын басу үшін вируленттілік факторы болып табылатын қымыздық қышқылын бөліп шығарады. Бұл қышқылдану процесі өсімдік жасуша қабырғасын әлсіретеді, саңырауқұлақ жасуша қабырғасын ыдырататын ферменттердің (CWDEs) қалыпты және тиімді жұмыс істеуі үшін қолайлы орта жасайды, бұл патогеннің физикалық кедергіні жеңіп, қожайын тіндеріне енуіне мүмкіндік береді (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum енгеннен кейін, полигалактуроназа және целлюлоза сияқты бірқатар CWDE бөліп шығарады, бұл оның жұқтырған тіндерде таралуын жеңілдетеді және тіндердің некрозын тудырады. Зақымданулардың және гифальды төсеніштердің өршуі ақ зеңнің тән белгілеріне әкеледі (Hegedus және Rimmer, 2005). Сонымен қатар, қожайын өсімдіктер патогенмен байланысты молекулалық үлгілерді (PAMP) үлгіні тану рецепторлары (PRRs) арқылы таниды, бұл қорғаныс реакцияларын белсендіретін бірқатар сигналдық оқиғаларды тудырады.
Ауруларды бақылау бойынша ондаған жылдар бойы жүргізілген күш-жігерге қарамастан, басқа да коммерциялық дақылдардағыдай, патогеннің төзімділігіне, тіршілік етуіне және бейімделуіне байланысты бұршақта жеткілікті төзімді гермоплазманың жетіспеушілігі сақталуда. Сондықтан ауруларды басқару өте қиын және мәдени тәжірибелердің, биологиялық бақылаудың және химиялық фунгицидтердің үйлесімін қамтитын кешенді, көп қырлы стратегияны қажет етеді (O'Sullivan et al., 2021). Ақ зеңді химиялық бақылау ең тиімді болып табылады, себебі фунгицидтер дұрыс және дұрыс уақытта қолданылған кезде аурудың таралуын тиімді түрде бақылауға, инфекцияның ауырлығын азайтуға және өнім шығынын азайтуға мүмкіндік береді. Дегенмен, фунгицидтерді шамадан тыс пайдалану және оларға шамадан тыс тәуелділік S. sclerotiorum төзімді штамдарының пайда болуына әкелуі және мақсатты емес организмдерге, топырақ денсаулығына және су сапасына кері әсер етуі мүмкін (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Сондықтан, экологиялық таза баламаларды табу басты басымдыққа айналды.
Путресцин, спермидин, спермин және кадаврин сияқты полиаминдер (ПА) топырақта таралатын өсімдік патогендеріне қарсы перспективалы балама ретінде қызмет ете алады, осылайша қауіпті химиялық фунгицидтерді пайдалануды толығымен немесе ішінара азайтады (Nehela және т.б., 2024; Yi және т.б., 2024). Жоғары сатыдағы өсімдіктерде ПА көптеген физиологиялық процестерге қатысады, соның ішінде, бірақ онымен шектелмей, жасушалардың бөлінуі, дифференциациясы және абиотикалық және биотикалық стресстерге жауап беруі (Killiny және Nehela, 2020). Олар антиоксиданттар ретінде әрекет ете алады, реактивті оттегі түрлерін (ROS) тазартуға көмектеседі, тотығу-тотықсыздану гомеостазын сақтай алады (Nehela және Killiny, 2023), қорғанысқа байланысты гендерді индукциялай алады (Romero және т.б., 2018), әртүрлі метаболикалық жолдарды реттейді (Nehela және Killiny, 2023), эндогендік фитогормондарды модуляциялай алады (Nehela және Killiny, 2019), жүйелік жүре пайда болған төзімділікті (SAR) орнатады және өсімдік-патогендік өзара әрекеттесуді реттейді (Nehela және Killiny, 2020; Asija және т.б., 2022; Czerwoniec, 2022). Өсімдіктерді қорғаудағы ПА-ның нақты механизмдері мен рөлдері өсімдік түрлеріне, патогендерге және қоршаған орта жағдайларына байланысты өзгеретінін атап өткен жөн. Өсімдіктердегі ең көп таралған ПА маңызды полиамин L-орнитиннен биосинтезделеді (Killiny және Nehela, 2020).
L-орнитин өсімдіктердің өсуі мен дамуында көптеген рөл атқарады. Мысалы, алдыңғы зерттеулер күріште (Oryza sativa) орнитиннің азотты қайта өңдеумен (Liu және т.б., 2018), күріштің өнімділігімен, сапасымен және хош иісімен (Lu және т.б., 2020) және су стрессіне жауап берумен (Yang және т.б., 2000) байланысты болуы мүмкін екенін көрсетті. Сонымен қатар, L-орнитинді экзогендік қолдану қант қызылшасында (Beta vulgaris) құрғақшылыққа төзімділікті айтарлықтай арттырды (Hussein және т.б., 2019) және пиязда (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu және Çavuşoǧlu, 2021) және кешьюде (Anacardium occidentale) өсімдіктерінде тұз стрессін жеңілдетті (da Rocha және т.б., 2012). L-орнитиннің абиотикалық стресстен қорғанудағы әлеуетті рөлі оның өңделген өсімдіктерде пролиннің жиналуына қатысуымен байланысты болуы мүмкін. Мысалы, пролин метаболизміне байланысты гендер, мысалы, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-OAT) және пролиндегидрогеназа (ProDH1 және ProDH2) гендерінің бұрын Nicotiana benthamiana және Arabidopsis thaliana штамдарын иесі емес Pseudomonas syringae штамдарынан қорғауға қатысатыны туралы хабарланған болатын (Senthil-Kumar және Mysore, 2012). Екінші жағынан, саңырауқұлақ орнитин декарбоксилазасы (ODC) патогеннің өсуі үшін қажет (Singh және т.б., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODC-ны иесі тудыратын генді өшіру (HIGS) арқылы нысанаға алу қызанақ өсімдіктерінің фузариозға төзімділігін айтарлықтай арттырды (Singh және т.б., 2020). Дегенмен, экзогенді орнитинді фитопатогенді бактериялар сияқты биотикалық стресстерге қарсы қолданудың әлеуетті рөлі жақсы зерттелген жоқ. Ең бастысы, орнитиннің ауруға төзімділікке әсері және онымен байланысты биохимиялық және физиологиялық құбылыстар әлі күнге дейін зерттелмеген.
Бұршақ тұқымдастардың S. sclerotiorum инфекциясының күрделілігін түсіну тиімді бақылау стратегияларын әзірлеу үшін маңызды. Бұл зерттеуде біз диамин L-орнитинінің қорғаныс механизмдерін және бұршақ өсімдіктерінің Sclerotinia sclerotiorum инфекциясына төзімділігін арттырудағы негізгі фактор ретіндегі әлеуетті рөлін анықтауды мақсат еттік. Біз жұқтырған өсімдіктердің қорғаныс реакцияларын күшейтумен қатар, L-орнитин тотығу-тотықсыздану мәртебесін сақтауда да маңызды рөл атқарады деп болжаймыз. Біз L-орнитиннің ықтимал әсерлері ферментативті және ферментативті емес антиоксиданттық қорғаныс механизмдерін реттеумен және саңырауқұлақ патогенділігі/вируленттік факторларымен және онымен байланысты ақуыздармен араласумен байланысты деп болжаймыз. L-орнитиннің бұл қос функциялылығы оны ақ зеңнің әсерін азайту және кең таралған бұршақ дақылдарының осы күшті саңырауқұлақ патогеніне төзімділігін арттырудың тұрақты стратегиясы үшін перспективалы кандидат етеді. Осы зерттеудің нәтижелері ақ зеңді бақылаудың инновациялық, экологиялық таза әдістерін әзірлеуге және оның бұршақ өндірісіне әсерін азайтуға көмектесуі мүмкін.
Бұл зерттеуде тәжірибелік материал ретінде қарапайым бұршақтың сезімтал коммерциялық сорты Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) пайдаланылды. Египеттегі Ауыл шаруашылығы зерттеулер орталығының (ARC) Егістік дақылдарын зерттеу институтының (FCRI) бұршақ тұқымдастарын зерттеу бөлімі сау тұқымдарды ұсынды. Жылыжай жағдайында (25 ± 2 °C, салыстырмалы ылғалдылық 75 ± 1%, 8 сағат жарық/16 сағат қараңғы) S. sclerotiorum жұқтырған топырақпен толтырылған пластикалық құмыраларға (ішкі диаметрі 35 см, тереңдігі 50 см) бес тұқым себілді. Егілгеннен кейін 7-10 күн өткен соң (DPS), әр құмырада біркелкі өсетін екі көшет және үш толық жайылған жапырақ қалдыру үшін көшеттерді сиретілді. Барлық құмырада өсірілген өсімдіктер екі апта сайын бір рет суарылып, ай сайын берілген сорт үшін ұсынылған мөлшерде тыңайтқыштар берілді.
500 мг/л концентрациядағы L-орнитиндиаминді (+)-(S)-2,5-диаминопентан қышқылы деп те аталады; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) дайындау үшін алдымен 50 мг 100 мл стерильді дистилденген суда ерітілді. Содан кейін негізгі ерітінді сұйылтылып, кейінгі тәжірибелерде қолданылды. Қысқаша айтқанда, L-орнитин концентрациясының алты сериясы (12,5, 25, 50, 75, 100 және 125 мг/л) in vitro сыналды. Сонымен қатар, оң бақылау ретінде стерильді дистилденген су (Mock) және коммерциялық фунгицид «Rizolex-T» 50% суланатын ұнтағы (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Гарбия губернаторлығы, Египет) пайдаланылды. «Rizolex-T» коммерциялық фунгициді in vitro жағдайында бес концентрацияда (2, 4, 6, 8 және 10 мг/л) сыналды.
Ақ зеңнің типтік белгілерін көрсететін (инфекция деңгейі: 10–30%) кәдімгі бұршақ сабақтары мен бүршіктерінің үлгілері коммерциялық шаруашылықтардан жиналды. Инфекцияланған өсімдік материалдарының көпшілігі түр/сорт бойынша анықталғанымен (сезімтал коммерциялық Giza 3 сорты), басқалары, әсіресе жергілікті базарлардан алынғандары, белгісіз түрлерге жатады. Жиналған зарарланған материалдар алдымен 0,5% натрий гипохлорит ерітіндісімен 3 минут бойы беткі қабатта зарарсыздандырылды, содан кейін стерильді дистилденген сумен бірнеше рет шайылып, артық суды кетіру үшін стерильді сүзгі қағазымен кептірілді. Содан кейін зарарланған мүшелер ортаңғы тіннен (сау және зарарланған тіндер арасында) кішкене бөліктерге кесіліп, картоп декстроза агарында (PDA) өсіріліп, склеротияның түзілуін ынталандыру үшін 25 ± 2 °C температурада 12 сағат жарық/12 сағат қараңғы циклмен 5 күн бойы инкубацияланды. Мицелий ұшы әдісі аралас немесе ластанған дақылдардан саңырауқұлақ изоляттарын тазарту үшін де қолданылды. Тазартылған саңырауқұлақ изоляты алдымен оның мәдени морфологиялық сипаттамаларына негізделіп анықталды, содан кейін микроскопиялық ерекшеліктеріне негізделіп S. sclerotiorum екені расталды. Соңында, барлық тазартылған изоляттар Кох постулаттарына сәйкес келетін сезімтал Giza 3 кәдімгі бұршақ сортында патогенділікке тексерілді.
Сонымен қатар, ең инвазивті S. sclerotiorum изоляты (изолят №3) White және т.б., 1990; Baturo-Ciesniewska және т.б., 2017 сипаттағандай, ішкі транскрипцияланған спейсер (ITS) секвенирлеуіне негізделіп расталды. Қысқаша айтқанда, изоляттар картоп декстрозасы сорпасында (PDB) өсіріліп, 25 ± 2 °C температурада 5-7 күн бойы инкубацияланды. Содан кейін саңырауқұлақ мицелийі жиналып, дәке арқылы сүзіліп, екі рет стерильді сумен жуылып, стерильді сүзгі қағазымен кептірілді. Геномдық ДНҚ Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah және т.б., 2022, 2024) көмегімен бөлініп алынды. Содан кейін ITS рДНҚ аймағы ITS1/ITS4 арнайы праймер жұбын (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; күтілетін өлшемі: 540 б.п.) пайдаланып күшейтілді (Baturo-Ciesniewska және т.б., 2017). Тазартылған ПТР өнімдері секвенирлеуге ұсынылды (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS рДНҚ тізбектері Sanger секвенирлеу әдісін қолдана отырып, екі бағытты түрде секвенирленді. Содан кейін жиналған сұрау тізбектері BLASTn бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып GenBank және Ұлттық биотехнологиялық ақпарат орталығындағы (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) соңғы деректермен салыстырылды. Сұрау тізбегі NCBI GenBank (қосымша кесте S1) ішіндегі соңғы деректерден алынған 20 басқа S. sclerotiorum штамдарымен/изоляттерімен Молекулалық эволюциялық генетика талдау пакетіндегі (MEGA-11; 11 нұсқасы) ClustalW көмегімен салыстырылды (Kumar et al., 2024). Эволюциялық талдау максималды ықтималдық әдісін және жалпы уақыт бойынша қайтымды нуклеотидті алмастыру моделін қолдану арқылы жүргізілді (Nei and Kumar, 2000). Ең жоғары логарифмдік ықтималдығы бар ағаш көрсетілген. Эвристикалық іздеуге арналған бастапқы ағаш көршілес қосылыс (NJ) ағашы (Kumar et al., 2024) мен максималды парсимония (MP) ағашы арасындағы логарифмдік ықтималдығы жоғары ағашты таңдау арқылы таңдалады. NJ ағашы жалпы уақыт бойынша қайтымды модельді қолдану арқылы есептелген жұптық қашықтық матрицасын қолдану арқылы құрастырылды (Nei and Kumar, 2000).
L-орнитин мен «Rizolex-T» бактерицидінің антибактериалды белсенділігі in vitro жағдайында агар диффузиясы әдісімен анықталды. Әдіс: L-орнитиннің негізгі ерітіндісінің тиісті мөлшерін (500 мг/л) алып, оны 10 мл PDA қоректік ортасымен мұқият араластырып, тиісінше 12,5, 25, 50, 75, 100 және 125 мг/л соңғы концентрациялары бар ерітінділерді дайындаңыз. Бақылау ретінде «Rizolex-T» фунгицидінің бес концентрациясы (2, 4, 6, 8 және 10 мг/л) және стерильді дистилденген су пайдаланылды. Орта қатқаннан кейін, диаметрі 4 мм болатын Sclerotinia sclerotiorum дақылының жаңа дайындалған мицелий тығынын Петри ыдысының ортасына ауыстырып, мицелий бақылау Петри ыдысын толығымен жапқанша 25±2°C температурада өсірді, содан кейін саңырауқұлақтардың өсуі тіркелді. 1-теңдеуді пайдаланып, S. sclerotiorum радиалды өсуінің тежелу пайызын есептеңіз:
Тәжірибе екі рет қайталанды, әрбір бақылау/тәжірибелік топ үшін алты биологиялық қайталау және әрбір биологиялық қайталау үшін бес құмыра (әр құмырада екі өсімдік) болды. Тәжірибелік нәтижелердің дәлдігін, сенімділігін және қайталануын қамтамасыз ету үшін әрбір биологиялық қайталау екі рет талданды (екі техникалық қайталау). Сонымен қатар, жартылай максималды ингибиторлық концентрацияны (IC50) және IC99 есептеу үшін пробит регрессиялық талдауы қолданылды (Prentice, 1976).
Жылыжай жағдайында L-орнитиннің әлеуетін бағалау үшін екі қатарынан құмыра эксперименттері жүргізілді. Қысқаша айтқанда, құмыралар зарарсыздандырылған сазды-құмды топырақпен (3:1) толтырылып, жаңа дайындалған S. sclerotiorum дақылымен егілді. Алдымен, S. sclerotiorum-ның ең инвазивті изоляты (№3 изоляты) бір склеротийді екіге бөліп, оны PDA-ға бетін төмен қаратып қойып, мицелияның өсуін ынталандыру үшін 25°C температурада тұрақты қараңғылықта (24 сағат) 4 күн инкубациялау арқылы өсірілді. Содан кейін алдыңғы шетінен диаметрі 5 мм төрт агар тығындары алынып, 100 г бидай мен күріш кебегінің стерильді қоспасымен (1:1, v/v) егілді және барлық колбалар склеротияның пайда болуын ынталандыру үшін 25 ± 2°C температурада 12 сағат жарық/12 сағат қараңғы циклде 5 күн инкубацияланды. Топырақ қоспас бұрын біртектілікті қамтамасыз ету үшін барлық колбалардың құрамы мұқият араластырылды. Содан кейін патогендердің тұрақты концентрациясын қамтамасыз ету үшін әр құмыраға 100 г колонизациялайтын кебек қоспасы қосылды. Саңырауқұлақтардың өсуін белсендіру үшін егілген құмыралар суарылып, 7 күн бойы жылыжай жағдайында орналастырылды.
Содан кейін әр құмыраға Giza 3 сортының бес тұқымы себілді. L-орнитинмен және Rizolex-T фунгицидімен өңделген құмыралар үшін зарарсыздандырылған тұқымдар алдымен екі қосылыстың сулы ерітіндісінде екі сағат бойы шамамен 250 мг/л және 50 мг/л соңғы IC99 концентрациясымен жібітілді, содан кейін себу алдында бір сағат бойы ауада кептірілді. Екінші жағынан, тұқымдар теріс бақылау ретінде зарарсыздандырылған дистилденген суға жібітілді. 10 күннен кейін, бірінші суару алдында, көшеттер сиретіліп, әр құмырада тек екі ұқыпты көшеттер қалды. Сонымен қатар, S. sclerotiorum инфекциясын қамтамасыз ету үшін, бірдей даму кезеңіндегі (10 күн) бұршақ өсімдігінің сабақтары зарарсыздандырылған скальпельді пайдаланып екі түрлі жерден кесіліп, әрбір жараға шамамен 0,5 г колонизациялайтын кебек қоспасы салынды, содан кейін барлық егілген өсімдіктерде инфекция мен аурудың дамуын ынталандыру үшін жоғары ылғалдылық енгізілді. Бақылау өсімдіктері де осылайша жараланды және аурудың дамуына қолайлы ортаны модельдеу және емдеу топтары арасындағы үйлесімділікті қамтамасыз ету үшін жараға тең мөлшерде (0,5 г) стерильді, колонизацияланбаған кебек қоспасы салынып, жоғары ылғалдылықта сақталды.
Емдеу әдісі: Бұршақ көшеттері топырақты суару арқылы 500 мл L-орнитин (250 мг/л) сулы ерітіндісімен немесе Rizolex-T фунгицидімен (50 мг/л) суарылды, содан кейін өңдеу 10 күн аралықпен үш рет қайталанды. Плацебомен өңделген бақылау өсімдіктері 500 мл стерильді дистилденген сумен суарылды. Барлық өңдеу жылыжай жағдайында (25 ± 2°C, 75 ± 1% салыстырмалы ылғалдылық және 8 сағат жарық/16 сағат қараңғы фотопериод) жүргізілді. Барлық құмыраларға екі апта сайын суару жүргізілді және ай сайын теңгерімді NPK тыңайтқышымен (20-20-20, 3,6% күкірт және TE микроэлементтері бар; Zain Seeds, Egypt) 3-4 г/л концентрациясында нақты сортқа арналған ұсыныстар мен өндірушінің нұсқауларына сәйкес жапырақ бүрку арқылы өңделді. Басқаша көрсетілмесе, толық кеңейтілген піскен жапырақтар (жоғарғы жағынан 2-ші және 3-ші жапырақтар) әрбір биологиялық көшірмеден өңдеуден кейін 72 сағаттан кейін (hpt) жиналып, гомогенделіп, біріктіріліп, -80 °C температурада тотығу стресс индикаторларының in situ гистохимиялық локализациясын, липидтердің асқын тотығуын, ферментативті және ферментативті емес антиоксиданттарды және ген экспрессиясын қоса алғанда, бірақ онымен шектелмей, қосымша талдаулар үшін сақталды.
Ақ зең инфекциясының қарқындылығы егуден кейін 21 күн сайын апта сайын бағаланды (dpi), ол 1-9 шкаласын (қосымша S2 кестесі) пайдаланып, Теран және т.б. (2006) өзгерткен Петцольдт және Диксон шкаласы (1996) негізінде бағаланды. Қысқаша айтқанда, бұршақ өсімдіктерінің сабақтары мен бұтақтары егу нүктесінен бастап, түйіндер мен түйіндер бойымен зақымданулардың дамуын бақылау үшін тексерілді. Содан кейін зақымданудың егу нүктесінен сабақ немесе бұтақ бойымен ең алыс нүктеге дейінгі қашықтығы өлшенді және зақымданудың орналасқан жеріне байланысты 1-9 балл берілді, мұнда (1) егу нүктесінің жанында көрінетін инфекцияның жоқтығын және (2-9) зақымдану мөлшерінің біртіндеп ұлғаюын және түйіндер/түйіндер бойымен прогрессияны көрсетті (қосымша S2 кестесі). Содан кейін ақ зең инфекциясының қарқындылығы 2-формуланы пайдаланып пайызға айналдырылды:
Сонымен қатар, аурудың өршу қисығы астындағы аудан (AUDPC) жақында кәдімгі бұршақтың ақ шірігіне бейімделген формула (Shaner and Finney, 1977) арқылы 3-теңдеуді қолдана отырып есептелді:
Мұндағы Yi = ti уақытындағы аурудың ауырлығы, Yi+1 = келесі уақыттағы аурудың ауырлығы ti+1, ti = бірінші өлшеу уақыты (күндермен), ti+1 = келесі өлшеу уақыты (күндермен), n = уақыт нүктелерінің немесе бақылау нүктелерінің жалпы саны. Өсімдіктің биіктігі (см), өсімдіктегі бұтақтар саны және өсімдіктегі жапырақтар санын қоса алғанда, бұршақ өсімдігінің өсу параметрлері барлық биологиялық қайталауларда 21 күн бойы апта сайын тіркелді.
Әрбір биологиялық қайталауда жапырақ үлгілері (жоғарғы жағынан екінші және үшінші толық дамыған жапырақтар) өңдеуден кейінгі 45-ші күні (соңғы өңдеуден 15 күн өткен соң) жиналды. Әрбір биологиялық қайталау бес құмырадан тұрды (әр құмырада екі өсімдік). Қараңғыда 4°C температурада 80% ацетонды пайдаланып, фотосинтетикалық пигменттерді (хлорофилл а, хлорофилл b және каротиноидтар) алу үшін шамамен 500 мг ұсақталған тін пайдаланылды. 24 сағаттан кейін үлгілер центрифугаланды және үстіңгі қабат хлорофилл а, хлорофилл b және каротиноидтардың құрамын UV-160A спектрофотометрімен (Shimadzu Corporation, Жапония) колориметриялық түрде анықтау үшін жиналды, бұл үшін үш түрлі толқын ұзындықтарында (A470, A646 және A663 нм) сіңірілуді өлшеу арқылы (Lichtenthaler, 1987) қолданылды. Соңында, фотосинтетикалық пигменттердің құрамы Lichtenthaler (1987) сипаттаған келесі 4-6 формулаларды пайдаланып есептелді.
Өңдеуден кейін 72 сағаттан кейін (hpt), сутегі асқын тотығының (H2O2) және супероксид анионының (O2•−) in situ гистохимиялық локализациясы үшін әрбір биологиялық көшірмеден жапырақтар (жоғарғы жағынан екінші және үшінші толық дамыған жапырақтар) жиналды. Әрбір биологиялық көшірме бес құмырадан тұрды (әр құмырада екі өсімдік). Әдістің дәлдігін, сенімділігін және қайталануын қамтамасыз ету үшін әрбір биологиялық көшірме екі рет талданды (екі техникалық көшірме). H2O2 және O2•− сәйкесінше 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) немесе нитрокөк тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) көмегімен анықталды, бұл әдісті Ромеро-Пуэртас және т.б. (2004) және Адам және т.б. (1989) сипаттаған әдістерге сәйкес, аздаған өзгертулермен қолданды. H2O2 гистохимиялық локализациясын in situ үшін парақшалар 10 мМ Tris буферінде (рН 7,8) 0,1% DAB ерітіндісімен вакуумда инфильтрацияланды, содан кейін бөлме температурасында жарықта 60 минут инкубацияланды. Парақшалар 4:1 (к/к) этанол:хлороформда (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) 0,15% (к/к) TCA ерітіндісінде ағартылды, содан кейін олар қараюғанша жарыққа қойылды. Сол сияқты, клапандар O2•− гистохимиялық локализациясын in situ үшін 0,1 w/k % HBT бар 10 мМ калий фосфаты буферімен (рН 7,8) вакуумда инфильтрацияланды. Парақшалар бөлме температурасында жарықта 20 минут инкубацияланды, содан кейін жоғарыдағыдай ағартылды, содан кейін қою көк/күлгін дақтар пайда болғанша жарықтандырылды. Нәтижесінде пайда болған қоңыр (H2O2 индикаторы ретінде) немесе көк-күлгін (O2•− индикаторы ретінде) түстің қарқындылығы ImageJ кескін өңдеу пакетінің Фиджи нұсқасын пайдаланып бағаланды (http://fiji.sc; 2024 жылдың 7 наурызында қолжетімді болды).
Малондальдегид (MDA; липидтердің асқын тотығуының маркері ретінде) Du және Bramlage (1992) әдісіне сәйкес аздаған өзгерістермен анықталды. Әрбір биологиялық көшірмеден алынған жапырақтар (жоғарғы жағынан екінші және үшінші толық дамыған жапырақтар) өңдеуден кейін 72 сағаттан соң (hpt) жиналды. Әрбір биологиялық көшірмеге бес құмыра (әр құмырада екі өсімдік) кірді. Әрбір биологиялық көшірме әдістің дәлдігін, сенімділігін және қайталануын қамтамасыз ету үшін екі рет талданды (екі техникалық көшірме). Қысқаша айтқанда, MDA экстракциясы үшін 0,5 г ұнтақталған жапырақ тінінің 20% трихлорсірке қышқылымен (TCA; MilliporeSigma, Берлингтон, MA, АҚШ) 0,01% бутилденген гидрокситолуол (BHT; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, АҚШ) бар ерітіндісі пайдаланылды. Содан кейін супернатанттағы MDA мөлшері UV-160A спектрофотометрін (Shimadzu Corporation, Жапония) пайдаланып 532 және 600 нм толқын ұзындығындағы сіңірілуді өлшеу арқылы колориметриялық түрде анықталды, содан кейін нмоль g−1 FW ретінде көрсетілді.
Ферменттік емес және ферменттік антиоксиданттарды бағалау үшін әр биологиялық көшірмеден өңдеуден кейін 72 сағаттан соң (hpt) жапырақтар (жоғарғы жағынан екінші және үшінші толық дамыған жапырақтар) жиналды. Әрбір биологиялық көшірме бес құмырадан тұрды (әр құмырада екі өсімдік). Әрбір биологиялық үлгі екі данадан талданды (екі техникалық үлгі). Екі жапырақ сұйық азотпен ұнтақталған және ферменттік және ферменттік емес антиоксиданттарды, жалпы аминқышқылдарын, пролин мөлшерін, ген экспрессиясын және оксалаттың сандық анықталуын анықтау үшін тікелей пайдаланылды.
Жалпы еритін фенолдар Folin-Ciocalteu реактивін (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АҚШ) пайдаланып, Кахконен және т.б. (1999) сипаттаған әдіске аздаған өзгертулер енгізе отырып анықталды. Қысқаша айтқанда, шамамен 0,1 г гомогенделген жапырақ тіндері 20 мл 80% метанолмен қараңғыда 24 сағат бойы экстракцияланды және центрифугалаудан кейін үстіңгі қабат жиналды. Үлгі экстрактының 0,1 мл-і 0,5 мл Folin-Ciocalteu реактивімен (10%) араластырылды, 30 секунд шайқалды және қараңғыда 5 минутқа қалдырылды. Содан кейін әрбір түтікке 0,5 мл 20% натрий карбонаты ерітіндісі (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каир, Египет) қосылды, мұқият араластырылды және бөлме температурасында қараңғыда 1 сағат бойы инкубацияланды. Инкубациядан кейін реакция қоспасының абсорбциясы 765 нм толқын ұзындығында UV-160A спектрофотометрін (Shimadzu Corporation, Жапония) пайдаланып өлшенді. Үлгі экстракттарындағы жалпы еритін фенолдардың концентрациясы галл қышқылын калибрлеу қисығын (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, АҚШ) пайдаланып анықталды және жаңа салмақтың бір граммына галл қышқылының эквивалентінің миллиграммымен (мг GAE g-1 жаңа салмақ) өрнектелді.
Жалпы еритін флавоноид мөлшері Джеридан және т.б. (2006) әдісі бойынша аздаған өзгертулермен анықталды. Қысқаша айтқанда, жоғарыда аталған метанол сығындысының 0,3 мл 0,3 мл 5% алюминий хлориді ерітіндісімен (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, АҚШ) араластырылып, қатты араластырылып, бөлме температурасында 5 минут инкубацияланды, содан кейін 0,3 мл 10% калий ацетаты ерітіндісі (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) қосылды, мұқият араластырылып, бөлме температурасында 30 минут қараңғыда инкубацияланды. Инкубациядан кейін реакция қоспасының абсорбциясы 430 нм толқын ұзындығында UV-160A спектрофотометрін (Shimadzu Corporation, Жапония) пайдаланып өлшенді. Үлгі сығындыларындағы жалпы еритін флавоноидтардың концентрациясы рутинді калибрлеу қисығын (TCI America, Портленд, Орегон, АҚШ) пайдаланып анықталды, содан кейін жаңа салмақтағы бір граммға рутин эквивалентінің миллиграммы ретінде көрсетілді (мг RE г-1 жаңа салмақ).
Бұршақ жапырақтарының жалпы бос аминқышқылдарының мөлшері Йокояма мен Хираматсу (2003) ұсынған және Сан және т.б. (2006) модификациялаған әдіске негізделген модификацияланған нингидрин реагентін (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АҚШ) пайдаланып анықталды. Қысқаша айтқанда, 0,1 г ұнтақталған тін рН 5,4 буферімен экстракцияланды, ал 200 мкл үстіңгі қабат 200 мкл нингидринмен (2%) және 200 мкл пиридинмен (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, АҚШ) әрекеттесті, қайнаған су ваннасында 30 минут инкубацияланды, содан кейін салқындатылып, UV-160A спектрофотометрін (Shimadzu Corporation, Жапония) пайдаланып 580 нм толқын ұзындығында өлшенді. Екінші жағынан, пролин Бейтс әдісімен анықталды (Бейтс және т.б., 1973). Пролин 3% сульфосалицил қышқылымен (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, MA, АҚШ) экстракцияланды және центрифугалаудан кейін 0,5 мл үстіңгі қабат 1 мл мұздық сірке қышқылымен (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, АҚШ) және нингидрин реагентімен араластырылды, 90°C температурада 45 минут инкубацияланды, салқындатылды және жоғарыдағыдай спектрофотометрді пайдаланып 520 нм толқын ұзындығында өлшенді. Жапырақ сығындыларындағы жалпы бос аминқышқылдары мен пролин глицин және пролинді калибрлеу қисықтарын (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, АҚШ) пайдаланып анықталды және мг/г жаңа салмақ ретінде көрсетілді.
Антиоксидантты ферменттердің ферментативті белсенділігін анықтау үшін шамамен 500 мг гомогенделген тін 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АҚШ) және 7,5% поливинилпирролидон (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АҚШ) бар 3 мл 50 мМ Tris буферімен (рН 7,8) экстракцияланды, 10 000 × g температурада тоңазытқышта (4 °C) 20 минут центрифугаланды, ал үстіңгі қабат (шикі фермент сығындысы) жиналды (El-Nagar және т.б., 2023; Osman және т.б., 2023). Содан кейін каталаза (CAT) 2 мл 0,1 М натрий фосфаты буферімен (рН 6,5; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, АҚШ) және 100 мкл 269 мМ H2O2 ерітіндісімен реакцияға түсіп, оның ферментативті белсенділігін Aebi (1984) әдісі бойынша аздаған өзгерістермен анықтады (El-Nagar және т.б., 2023; Osman және т.б., 2023). Гуайакольге тәуелді пероксидазаның (POX) ферментативті белсенділігі Харрах және т.б. (2009) әдісін қолдана отырып анықталды. (2008) шағын модификациялармен (El-Nagar және т.б., 2023; Osman және т.б., 2023) және полифенолоксидазаның (PPO) ферментативті белсенділігі 2,2 мл 100 мМ натрий фосфаты буферімен (рН 6,0), 100 мкл гуайакольмен (TCI chemicals, Портленд, Орегон, АҚШ) және 100 мкл 12 мМ H2O2 реакциясынан кейін анықталды. Әдіс (El-Nagar және т.б., 2023; Osman және т.б., 2023) аздап өзгертілді. Талдау 0,1 М фосфат буферінде (рН 6,0) жаңа дайындалған 3 мл катехол ерітіндісімен (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АҚШ) (0,01 М) реакциядан кейін жүргізілді. CAT белсенділігі H2O2 ыдырауын 240 нм (A240) толқын ұзындығында бақылау арқылы өлшенді, POX белсенділігі 436 нм (A436) толқын ұзындығында сіңірілудің жоғарылауын бақылау арқылы өлшенді, ал PPO белсенділігі UV-160A спектрофотометрін (Шимадзу, Жапония) пайдаланып, әрбір 30 секунд сайын 495 нм (A495) толқын ұзындығында сіңірілу ауытқуларын тіркеу арқылы өлшенді.
Соңғы өңдеуден кейін 72 сағаттан кейін бұршақ жапырақтарындағы (жоғарғы жағынан екінші және үшінші толық дамыған жапырақтар) пероксисомальды каталаза (PvCAT1; GenBank Accession № KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank Accession № XM_068639556.1) және глутатионредуктаза (PvGR; GenBank Accession № KY195009.1) сияқты үш антиоксидантқа байланысты геннің транскрипт деңгейлерін анықтау үшін нақты уақыт режиміндегі RT-ПТР қолданылды. Қысқаша айтқанда, РНҚ өндірушінің хаттамасына сәйкес Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Қытай) көмегімен бөлініп алынды. Содан кейін, өндірушінің нұсқауларына сәйкес TOP script™ cDNA Synthesis Kit көмегімен кДНҚ синтезделді. Жоғарыда аталған үш геннің праймерлік тізбектері S3 қосымша кестесінде келтірілген. PvActin-3 (GenBank тіркеу нөмірі: XM_068616709.1) үй шаруашылығы гені ретінде пайдаланылды және геннің салыстырмалы экспрессиясы 2-ΔΔCT әдісін қолдану арқылы есептелді (Livak және Schmittgen, 2001). Биотикалық стресс (кәдімгі бұршақ тұқымдастар мен антракноз саңырауқұлағы Colletotrichum lindemuthianum арасындағы үйлесімсіз әрекеттесу) және абиотикалық стресс (құрғақшылық, тұздылық, төмен температура) кезіндегі актиннің тұрақтылығы көрсетілді (Borges және т.б., 2012).
Бастапқыда біз S. sclerotiorum-дағы оксалоацетат ацетилгидролаза (OAH) ақуыздарының геномдық кремнийдегі талдауын ақуыз-ақуыз BLAST құралын (BLASTp 2.15.0+) пайдаланып жүргіздік (Altschul және т.б., 1997, 2005). Қысқаша айтқанда, біз S. sclerotiorum-дағы гомологиялық ақуызды (таксид: 5180) картаға түсіру үшін сұрау тізбегі ретінде Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank тіркелу нөмірі XP_040799428.1; 342 аминқышқылы) және Penicillium lagena-дан алынған OAH-ты (PlOAH; таксид: 94218; GenBank тіркелу нөмірі XP_056833920.1; 316 аминқышқылы) пайдаландық. BLASTp Ұлттық биотехнологиялық ақпарат орталығының (NCBI) веб-сайтындағы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBank-тағы ең соңғы қолжетімді S. sclerotiorum геномының деректеріне қарсы жүргізілді.
Сонымен қатар, S. sclerotiorum-нан болжанған OAH гені (SsOAH) және A. fijiensis CBS 313.89-дан AfOAH және P. lagena-дан PlOAH эволюциялық талдауы мен филогенетикалық ағашы MEGA11-дегі максималды ықтималдық әдісін (Tamura et al., 2021) және JTT матрицасына негізделген модельді (Jones et al., 1992) пайдаланып анықталды. Филогенетикалық ағаш S. sclerotiorum-нан болжанған барлық OAH гендерінің (SsOAH) ақуыз тізбектерінің көптік туралау талдауымен және шектеуге негізделген туралау құралын (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) пайдаланып сұрау тізбегімен біріктірілді (Papadopoulos және Agarwala, 2007). Сонымен қатар, S. sclerotiorum-нан алынған SsOAH аминқышқылдарының ең жақсы сәйкес келетін тізбектері ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) көмегімен сұрау тізбектерімен (AfOAH және PlOAH) (Larkin және т.б., 2007) тураланды, ал туралаудағы сақталған аймақтар ESPript құралын (3.0 нұсқасы; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) пайдаланып визуализацияланды.
Сонымен қатар, болжамды функционалды репрезентативті домендері мен S. sclerotiorum SsOAH сақталған учаскелері InterPro құралын (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) пайдаланып әртүрлі тұқымдастарға интерактивті түрде жіктелді (Blum және т.б., 2021). Соңында, болжамды S. sclerotiorum SsOAH үш өлшемді (3D) құрылымдық модельдеу Ақуыз гомологиясы/аналогиясын тану механизмін (Phyre2 сервер нұсқасы 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley және т.б., 2015) пайдаланып орындалды және SWISS-MODEL серверін (https://swissmodel.expasy.org/) пайдаланып тексерілді (Biasini және т.б., 2014). Болжамдалған үш өлшемді құрылымдар (PDB форматы) UCSF-Chimera пакетін (1.15 нұсқасы; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) пайдаланып интерактивті түрде визуализацияланды (Петтерсен және т.б., 2004).
Sclerotinia sclerotiorum мицелийіндегі оксалоацетат ацетилгидролазасының (SsOAH; GenBank кіру нөмірі: XM_001590428.1) транскрипциялық деңгейін анықтау үшін сандық нақты уақыттағы флуоресценциялық ПТР қолданылды. Қысқаша айтқанда, S. sclerotiorum PDB бар колбаға егіліп, мицелияның өсуін ынталандыру үшін 25 ± 2 °C температурада 24 сағат бойы 150 айн/мин жылдамдықпен және тұрақты қараңғылықта (24 сағат) шайқалатын инкубаторға (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, АҚШ) орналастырылды. Осыдан кейін жасушалар L-орнитинмен және Rizolex-T фунгицидімен соңғы IC50 концентрациясында (сәйкесінше шамамен 40 және 3,2 мг/л) өңделді, содан кейін сол жағдайларда тағы 24 сағат бойы өсірілді. Инкубациядан кейін дақылдар 2500 айн/мин жылдамдықпен 5 минут бойы центрифугаланды және ген экспрессиясын талдау үшін үстіңгі қабат (саңырауқұлақ мицелийі) жиналды. Сол сияқты, саңырауқұлақ мицелийі инфекциядан кейін 0, 24, 48, 72, 96 және 120 сағаттан кейін жұқтырған тіндердің бетінде ақ зең мен мақта тәрізді мицелий пайда болған жұқтырған өсімдіктерден жиналды. Саңырауқұлақ мицелийінен РНҚ бөлініп алынды, содан кейін кДНҚ жоғарыда сипатталғандай синтезделді. SsOAH үшін праймер тізбектері S3 қосымша кестесінде келтірілген. SsActin (GenBank кіру нөмірі: XM_001589919.1) үй шаруашылығы гені ретінде пайдаланылды, ал салыстырмалы ген экспрессиясы 2-ΔΔCT әдісін қолдана отырып есептелді (Livak және Schmittgen, 2001).
Қымыздық қышқылы картоп декстроза сорпасында (PDB) және Sclerotinia sclerotiorum саңырауқұлақ патогені бар өсімдік үлгілерінде аздаған өзгерістермен анықталды. Қысқаша айтқанда, S. sclerotiorum изоляттары PDB бар колбаларға егіліп, содан кейін мицелияның өсуін ынталандыру үшін шайқау инкубаторында (I2400 моделі, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, АҚШ) 150 айн/мин жылдамдықпен 25 ± 2 °C температурада 3-5 күн бойы тұрақты қараңғылықта (24 сағат) өсірілді. Инкубациядан кейін саңырауқұлақ дақылы алдымен Whatman #1 сүзгі қағазы арқылы сүзіліп, содан кейін қалдық мицелийді кетіру үшін 2500 айн/мин жылдамдықпен 5 минут бойы центрифугаланды. Супернатант жиналып, оксалатты одан әрі сандық анықтау үшін 4°C температурада сақталды. Өсімдік үлгілерін дайындау үшін шамамен 0,1 г өсімдік тінінің фрагменттері дистилденген сумен үш рет (әр жолы 2 мл) экстракцияланды. Содан кейін үлгілер 2500 айн/мин жылдамдықпен 5 минут бойы центрифугаланды, үстіңгі қабат құрғақ түрде Whatman №1 сүзгі қағазы арқылы сүзіліп, әрі қарай талдау үшін жиналды.
Қымыздық қышқылын сандық талдау үшін реакция қоспасы шыны тығынды түтікте келесі ретпен дайындалды: 0,2 мл үлгі (немесе PDB дақылының фильтраты немесе қымыздық қышқылының стандартты ерітіндісі), 0,11 мл бромфенол көк (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Питтсбург, Пенсильвания, АҚШ), 0,198 мл 1 М күкірт қышқылы (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) және 0,176 мл 100 мМ калий дихроматы (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Орегон, АҚШ), содан кейін ерітінді тазартылған сумен 4,8 мл дейін сұйылтылды, қарқынды араластырылды және дереу 60 °C су ваннасына салынды. 10 минуттан кейін реакция 0,5 мл натрий гидроксиді ерітіндісін (NaOH; 0,75 М) қосу арқылы тоқтатылды. Реакция қоспасының абсорбциясы (A600) 600 нм толқын ұзындығында UV-160 спектрофотометрін (Shimadzu Corporation, Жапония) пайдаланып өлшенді. Дақыл фильтраттары мен өсімдік үлгілерін сандық анықтау үшін PDB және дистилденген су бақылау ретінде пайдаланылды. Дақыл фильтраттарындағы қымыздық қышқылының концентрациясы, PDB ортасының миллилитріне шаққандағы қымыздық қышқылының микрограммымен (μg.mL−1) және жапырақ сығындыларындағы, жаңа салмақтың бір граммына шаққандағы қымыздық қышқылының микрограммымен (μg.g−1 FW) көрсетілген, қымыздық қышқылын калибрлеу қисығын (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, АҚШ) пайдаланып анықталды.
Зерттеу барысында барлық эксперименттер толығымен рандомизацияланған дизайнда (CRD) жасалды, онда әр өңдеуге алты биологиялық қайталау және әр биологиялық қайталауға бес құмыра (әр құмыраға екі өсімдік) қолданылды. Биологиялық қайталаулар қайталанатын түрде талданды (екі техникалық қайталау). Техникалық қайталаулар сол эксперименттің қайталануын тексеру үшін пайдаланылды, бірақ жалған қайталауларды болдырмау үшін статистикалық талдауда пайдаланылмады. Деректер дисперсия талдауы (ANOVA) және одан кейін Туки-Крамердің шын мәніндегі маңызды айырмашылық (HSD) сынағы (p ≤ 0,05) арқылы статистикалық тұрғыдан талданды. In vitro эксперименттері үшін IC50 және IC99 мәндері probit моделін пайдаланып есептелді және 95% сенімділік аралықтары есептелді.
Мысырдың Эль-Габия губернаторлығындағы әртүрлі соя егістіктерінен барлығы төрт изолят жиналды. PDA ортасында барлық изоляттар кілегейлі ақ мицелий түзді, ол тез мақта тәрізді ақ түске айналды (1А сурет), содан кейін склеротий сатысында бежевый немесе қоңыр түсті болды. Склеротийлер әдетте тығыз, қара, сфералық немесе дұрыс емес пішінді, ұзындығы 5,2-ден 7,7 мм-ге дейін және диаметрі 3,4-тен 5,3 мм-ге дейін болады (1B сурет). Төрт изолят 25 ± 2 °C температурада 10-12 күн инкубациядан кейін қоректік ортаның шетінде склеротийдің шеткі үлгісін дамытқанымен (1А сурет), пластинадағы склеротийлер саны олардың арасында айтарлықтай ерекшеленді (P < 0,001), 3-ші изолятта склеротийлер саны ең көп болды (пластинадағы 32,33 ± 1,53 склеротий; 1C сурет). Сол сияқты, №3 изолят басқа изоляттарға қарағанда PDB-де көбірек қымыздық қышқылын өндірді (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; 1D сурет). №3 изолят фитопатогенді саңырауқұлақ Sclerotinia sclerotiorum-ның типтік морфологиялық және микроскопиялық сипаттамаларын көрсетті. Мысалы, PDA-да №3 изолят колониялары тез өсті, кілегейлі ақ түсті (1A сурет), кері бежевый немесе ашық албырт сары-қоңыр түсті болды және диаметрі 9 см болатын пластинаның бетін толығымен жабу үшін 25 ± 2°C температурада 6-7 күн қажет болды. Жоғарыда аталған морфологиялық және микроскопиялық сипаттамаларға сүйене отырып, №3 изолят Sclerotinia sclerotiorum ретінде анықталды.
1-сурет. Кәдімгі бұршақ дақылдарынан алынған S. sclerotiorum изоляттарының сипаттамасы мен патогенділігі. (A) PDA ортасындағы төрт S. sclerotiorum изолятының мицелийлік өсуі, (B) төрт S. sclerotiorum изолятының склеротиясы, (C) склеротиялар саны (бір пластинада), (D) PDB ортасындағы қымыздық қышқылының секрециясы (мкг.мЛ−1) және (E) жылыжай жағдайындағы сезімтал коммерциялық бұршақ дақылы Giza 3 сортындағы төрт S. sclerotiorum изолятының ауру ауырлығы (%). Мәндер бес биологиялық қайталаудың орташа ± SD мәнін білдіреді (n = 5). Әртүрлі әріптер емдеу арасындағы статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p < 0,05). (F–H) 3-ші изолятпен (dpi) егуден кейін 10 күннен кейін жер үсті сабақтары мен силикаларында типтік ақ зең белгілері пайда болды. (I) S. sclerotiorum #3 изолятының ішкі транскрипцияланған спейсер (ITS) аймағының эволюциялық талдауы максималды ықтималдық әдісін қолдана отырып жүргізілді және Ұлттық биотехнологиялық ақпарат орталығының (NCBI) дерекқорынан (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) алынған 20 анықтамалық изолят/штамммен салыстырылды. Кластерлеу сызықтарының үстіндегі сандар аймақтың қамтуын (%), ал кластерлеу сызықтарының астындағы сандар тармақтың ұзындығын көрсетеді.
Сонымен қатар, патогенділікті растау үшін алынған төрт S. sclerotiorum изоляттары жылыжай жағдайында сезімтал коммерциялық бұршақ сорты Giza 3-ті егу үшін пайдаланылды, бұл Кох постулаттарына сәйкес келеді (1E сурет). Алынған барлық саңырауқұлақ изоляттары патогенді болып, жасыл бұршақты жұқтыруы мүмкін болса да (Giza 3-ке сілтеме жасаңыз), егуден кейін 10 күн өткен соң (dpi) барлық жер үсті бөліктерінде (1F сурет), әсіресе сабақтарында (1G сурет) және бүршіктерінде (1H сурет) типтік ақ зең белгілерін тудыруы мүмкін болса да, 3-ші изолят екі тәуелсіз экспериментте ең агрессивті изолят болды. 3-ші изолят бұршақ өсімдіктерінде аурудың ең жоғары ауырлығына (%) ие болды (инфекциядан кейін 7, 14 және 21 күн өткен соң сәйкесінше 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 және 76,7 ± 3,1; 1F сурет).
Ең инвазивті S. sclerotiorum изоляты №3 ішкі транскрипцияланған спейсер (ITS) секвенирлеуіне негізделіп, одан әрі расталды (1I сурет). №3 изоляты мен 20 анықтамалық изолят/штамм арасындағы филогенетикалық талдау олардың арасында жоғары ұқсастықты (>99%) көрсетті. Айта кету керек, S. sclerotiorum №3 изоляты (533 б.п.) құрғақ бұршақ тұқымдарынан бөлініп алынған американдық S. sclerotiorum изоляты LPM36 (GenBank тіркеу нөмірі MK896659.1; 540 б.п.) және қытайлық S. sclerotiorum изоляты YKY211 (GenBank тіркеу нөмірі OR206374.1; 548 б.п.)-ға жоғары ұқсастыққа ие, бұл күлгін (Matthiola incana) сабағының шірігін тудырады, олардың барлығы дендрограмманың жоғарғы жағында бөлек топтастырылған (1I сурет). Жаңа тізбек NCBI дерекқорына сақталып, «Sclerotinia sclerotiorum – изолят YN-25» (GenBank тіркеу нөмірі PV202792) деп аталды. 3-ші изолят ең инвазивті изолят екенін көруге болады; сондықтан бұл изолят кейінгі барлық тәжірибелерде зерттеу үшін таңдалды.
Диамин L-орнитинінің (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) әртүрлі концентрацияларда (12,5, 25, 50, 75, 100 және 125 мг/л) S. sclerotiorum изоляты 3-ке қарсы бактерияға қарсы белсенділігі in vitro зерттелді. L-орнитиннің бактерияға қарсы әсер көрсеткені және S. sclerotiorum hyphae-нің радиалды өсуін дозаға тәуелді түрде біртіндеп тежегені атап өтілді (2A, B суреттер). Сыналған ең жоғары концентрацияда (125 мг/л) L-орнитин мицелий өсуінің ең жоғары тежелу жылдамдығын көрсетті (99,62 ± 0,27%; 2B сурет), бұл сыналған ең жоғары концентрацияда (10 мг/л) коммерциялық фунгицид Rizolex-T-ге баламалы болды (тежелу жылдамдығы 99,45 ± 0,39%; 2C сурет), бұл ұқсас тиімділікті көрсетеді.
2-сурет. L-орнитиннің Sclerotinia sclerotiorum-ға қарсы in vitro антибактериалды белсенділігі. (A) L-орнитиннің S. sclerotiorum-ға қарсы әртүрлі концентрацияларының антибактериалды белсенділігін коммерциялық Rizolex-T фунгицидімен (10 мг/л) салыстыру. (B, C) Әр түрлі концентрациядағы L-орнитинмен (12,5, 25, 50, 75, 100 және 125 мг/л) немесе Rizolex-T (2, 4, 6, 8 және 10 мг/л) өңдегеннен кейінгі S. sclerotiorum мицелийінің өсуінің тежелу деңгейі (%). Мәндер бес биологиялық қайталаудың орташа ± SD мәнін білдіреді (n = 5). Әр түрлі әріптер емдеу арасындағы статистикалық айырмашылықтарды білдіреді (p < 0,05). (D, E) L-орнитин мен коммерциялық Rizolex-T фунгицидінің пробит моделінің регрессиялық талдауы сәйкесінше. Пробит моделінің регрессия сызығы көк сызықпен, ал сенімділік аралығы (95%) қызыл сызықпен көрсетілген.
Сонымен қатар, пробит регрессиясын талдау жүргізілді және сәйкес графиктер 1-кестеде және 2D, E суреттерінде көрсетілген. Қысқаша айтқанда, L-орнитиннің қолайлы көлбеулік мәні (y = 2.92x − 4.67) және онымен байланысты маңызды статистика (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 және p < 0.0001; 2D сурет) коммерциялық фунгицид Rizolex-T-мен салыстырғанда (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 және p < 0.0001) S. sclerotiorum-ға қарсы зеңге қарсы белсенділіктің жоғарылағанын көрсетті (1-кесте).
1-кесте. S. sclerotiorum-ға қарсы L-орнитин мен коммерциялық «Rizolex-T» фунгицидінің жартылай максималды тежегіш концентрациясының (IC50) және IC99 (мг/л) мәндері.
Жалпы алғанда, L-орнитин (250 мг/л) емделмеген S. sclerotiorum жұқтырған өсімдіктермен салыстырғанда өңделген кәдімгі бұршақ өсімдіктерінде ақ зеңнің дамуы мен ауырлығын айтарлықтай төмендетті (бақылау; 3A сурет). Қысқаша айтқанда, емделмеген жұқтырған бақылау өсімдіктерінің ауру ауырлығы біртіндеп артқанымен (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 және 92,33 ± 3,06%), L-орнитин емдеуден кейін 7, 14 және 21 күннен кейін (dpt) эксперимент барысында аурудың ауырлығын (%) айтарлықтай төмендетті (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 және 26,36 ± 3,07) (3A сурет). Сол сияқты, S. sclerotiorum жұқтырған бұршақ өсімдіктері 250 мг/л L-орнитинмен өңделген кезде, аурудың өршу қисығы астындағы аудан (AUDPC) емделмеген бақылаудағы 1274,33 ± 33,13-тен 281,03 ± 7,95-ке дейін төмендеді, бұл оң бақылаудағы 50 мг/л Rizolex-T фунгицидінен (183,61 ± 7,71; 3B сурет) сәл төмен болды. Екінші тәжірибеде де осындай үрдіс байқалды.
Сурет 3. L-орнитинді экзогендік қолданудың жылыжай жағдайында Sclerotinia sclerotiorum тудырған кәдімгі бұршақтың ақ шірігінің дамуына әсері. (A) 250 мг/л L-орнитинмен өңдегеннен кейінгі кәдімгі бұршақтың ақ зеңінің ауру өршу қисығы. (B) L-орнитинмен өңдегеннен кейінгі кәдімгі бұршақтың ақ зеңінің ауру өршу қисығының астындағы аудан (AUDPC). Мәндер бес биологиялық қайталаудың орташа ± SD мәнін білдіреді (n = 5). Әртүрлі әріптер емдеу арасындағы статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтарды білдіреді (p < 0,05).
250 мг/л L-орнитинді экзогендік қолдану 42 күннен кейін өсімдіктің биіктігін (4А сурет), өсімдіктегі бұтақтар санын (4В сурет) және өсімдіктегі жапырақтар санын (4С сурет) біртіндеп арттырды. Rizolex-T коммерциялық фунгициді (50 мг/л) зерттелген барлық қоректік параметрлерге ең үлкен әсер еткенімен, 250 мг/л L-орнитинді экзогендік қолдану емделмеген бақылау тобымен салыстырғанда екінші ең үлкен әсерге ие болды (4А–С суреттер). Екінші жағынан, L-орнитинмен емдеу фотосинтетикалық пигменттер хлорофилл a (4D сурет) және хлорофилл b (4E сурет) құрамына айтарлықтай әсер еткен жоқ, бірақ теріс бақылау (0,44 ± 0,02 мг/г fr wt) және оң бақылау (0,46 ± 0,02 мг/г fr wt; 4F сурет) тобымен салыстырғанда жалпы каротиноид мөлшерін (0,56 ± 0,03 мг/г fr wt) сәл арттырды. Жалпы алғанда, бұл нәтижелер L-орнитиннің өңделген бұршақ тұқымдастарға фитотоксикалық емес екенін және тіпті олардың өсуін ынталандыруы мүмкін екенін көрсетеді.
4-сурет. Жылыжай жағдайында Sclerotinia sclerotiorum жұқтырған бұршақ жапырақтарының өсу сипаттамалары мен фотосинтетикалық пигменттеріне экзогендік L-орнитинді қолданудың әсері. (A) Өсімдіктің биіктігі (см), (B) Өсімдіктегі бұтақтар саны, (C) Өсімдіктегі жапырақтар саны, (D) Хлорофиллдің мөлшері (мг г-1 fr салмағы), (E) Хлорофиллдің мөлшері (мг г-1 fr салмағы), (F) Жалпы каротиноидтардың мөлшері (мг г-1 fr салмағы). Мәндер бес биологиялық қайталаудың орташа ± SD мәні болып табылады (n = 5). Әртүрлі әріптер емдеу арасындағы статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p < 0,05).
Реактивті оттегі түрлерінің (ROS; сутегі асқын тотығы [H2O2] ретінде көрсетілген) және бос радикалдардың (супероксид аниондары [O2•−] ретінде көрсетілген) in situ гистохимиялық локализациясы L-орнитинді (250 мг/л) экзогендік қолдану емделмеген жұқтырған өсімдіктердің (сәйкесінше 173,31 ± 12,06 және 149,35 ± 7,94 нмоль.г−1 FW) және 50 мг/л коммерциялық Rizolex-T фунгицидімен өңделген өсімдіктердің (сәйкесінше 170,12 ± 9,50 және 157,00 ± 7,81 нмоль.г−1 fr wt) жиналуымен салыстырғанда H2O2 (96,05 ± 5,33 нмоль.г−1 FW; 5A сурет) және O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль.г−1 FW; 5B сурет) жиналуын айтарлықтай төмендеткенін көрсетті. 72 сағатта. Hpt кезінде H2O2 және O2•− жоғары деңгейлері жиналды (5A, B сурет). Сол сияқты, TCA негізіндегі малониальдегид (MDA) талдауы S. sclerotiorum жұқтырған бұршақ өсімдіктерінің жапырақтарында MDA жоғары деңгейлерін (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) жинағанын көрсетті (5C сурет). Дегенмен, L-орнитинді экзогендік қолдану липидтердің асқын тотығуын айтарлықтай төмендетті, бұл өңделген өсімдіктердегі MDA мөлшерінің төмендеуімен дәлелденді (33,08 ± 4,00 нмоль.г fr wt).
5-сурет. Жылыжай жағдайында инфекциядан кейін 72 сағаттан соң S. sclerotiorum жұқтырған бұршақ жапырақтарындағы тотығу стрессінің негізгі маркерлеріне және ферментативті емес антиоксиданттық қорғаныс механизмдеріне экзогендік L-орнитинді қолданудың әсері. (A) 72 ат күші кезінде сутегі асқын тотығы (H2O2; нмоль г−1 FW), (B) 72 ат күші кезінде супероксид анионы (O2•−; нмоль г−1 FW), (C) 72 ат күші кезінде малониальдегид (MDA; нмоль г−1 FW), (D) 72 ат күші кезінде жалпы еритін фенолдар (мг GAE g−1 FW), (E) 72 ат күші кезінде жалпы еритін флавоноидтар (мг RE g−1 FW), (F) 72 ат күші кезінде жалпы бос аминқышқылдары (мг г−1 FW) және (G) 72 ат күші кезінде пролин мөлшері (мг г−1 FW). Мәндер 5 биологиялық қайталаудың орташа ± стандартты ауытқуын (орташа ± SD) білдіреді (n = 5). Әртүрлі әріптер емдеу әдістері арасындағы статистикалық тұрғыдан маңызды айырмашылықтарды көрсетеді (p < 0,05).