Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Жүктеме мөлшері жоғары инсулин нанобөлшектері (НБ) әртүрлі дозалау формаларында әртүрлі қолданыстарды тапты. Бұл жұмыс криопротектор ретінде маннитолды қолданумен немесе қолданбай, инсулинмен толтырылған хитозан нанобөлшектерінің құрылымына мұздатып кептіру және шашыратып кептіру процестерінің әсерін бағалауға бағытталған. Біз сондай-ақ бұл нанобөлшектердің сапасын оларды қайта еріту арқылы бағаладық. Сусыздандыру алдында хитозан/натрий триполифосфаты/инсулинмен көлденең байланысқан нанобөлшектердің бөлшектерінің өлшемі 318 нм, PDI 0,18, капсуляция тиімділігі 99,4% және жүктеме 25,01% болды. Қалпына келтіргеннен кейін, маннитолды қолданбай мұздатып кептіру әдісімен алынған нанобөлшектерден басқа барлық нанобөлшектер өздерінің сфералық бөлшектер құрылымын сақтап қалды. Кез келген бүрку арқылы кептірілген маннитол бар нанобөлшектермен салыстырғанда, маннитолсыз шашыратып кептірілген нанобөлшектер де ең кіші орташа бөлшектер өлшемін (376 нм) және ең жоғары жүктемені көрсетті. кептіру немесе мұздатып кептіру әдістерімен ұқсас инкапсуляция жылдамдығымен (98,7%) және PDI (0,20) мөлшерімен (25,02%). Маннитолсыз шашыратып кептіру арқылы кептірілген нанобөлшектер инсулиннің ең жылдам бөлінуіне және жасушалардың сіңуінің ең жоғары тиімділігіне әкелді. Бұл жұмыс шашыратып кептіру дәстүрлі мұздатып кептіру әдістерімен салыстырғанда криопротекторларды қажет етпей инсулин нанобөлшектерін сусыздандыра алатынын көрсетеді, бұл үлкен жүктеме сыйымдылығын, төмен қоспа талаптарын және пайдалану шығындарын тудырады, бұл айтарлықтай артықшылық болып табылады.
19221,2,3 жылы ашылғаннан бері инсулин және оның фармацевтикалық препараттары 1 типті қант диабеті (Т1ҚД) және 2 типті қант диабеті (Т1ҚД) бар науқастардың өмірін сақтап қалды. Дегенмен, жоғары молекулалық салмақты ақуыз ретіндегі қасиеттеріне байланысты инсулин оңай агрегацияланады, протеолитикалық ферменттермен ыдырайды және бірінші өту әсерімен жойылады. 1 типті қант диабеті диагнозы қойылған адамдарға өмір бойы инсулин инъекциялары қажет. Бастапқыда 2 типті қант диабеті диагнозы қойылған көптеген науқастарға ұзақ мерзімді инсулин инъекциялары қажет. Күнделікті инсулин инъекциялары бұл адамдар үшін күнделікті ауырсыну мен ыңғайсыздықтың маңызды көзі болып табылады, бұл психикалық денсаулыққа кері әсер етеді. Нәтижесінде, инсулинді ішу арқылы енгізу сияқты аз ыңғайсыздық тудыратын инсулинді енгізудің басқа түрлері кеңінен зерттелуде5, себебі олар бүкіл әлемде қант диабетімен ауыратын шамамен 5 миллиард адамның өмір сүру сапасын қалпына келтіру мүмкіндігіне ие.
Нанобөлшектер технологиясы ішке қабылдау кезінде инсулинді қабылдау әрекеттерінде айтарлықтай ілгерілеушілікке қол жеткізді4,6,7. Инсулинді тиімді түрде капсулалап, дененің белгілі бір жерлеріне мақсатты түрде жеткізу үшін ыдыраудан қорғайды. Дегенмен, нанобөлшектер формулаларын қолданудың бірнеше шектеулері бар, негізінен бөлшектердің суспензияларының тұрақтылық мәселелеріне байланысты. Сақтау кезінде кейбір агрегациялар орын алуы мүмкін, бұл инсулинмен толтырылған нанобөлшектердің биожетімділігін төмендетеді8. Сонымен қатар, инсулин нанобөлшектерінің (НБ) тұрақтылығын қамтамасыз ету үшін нанобөлшектер мен инсулиннің полимерлік матрицасының химиялық тұрақтылығын да ескеру қажет. Қазіргі уақытта мұздатып кептіру технологиясы сақтау кезінде қажетсіз өзгерістердің алдын ала отырып, тұрақты НБ жасаудың алтын стандарты болып табылады9.
Дегенмен, мұздатып кептіру үшін мұз кристалдарының механикалық кернеуінің әсерінен NP-лердің сфералық құрылымына әсер етудің алдын алу үшін криопротекторларды қосу қажет. Бұл лиофилизациядан кейін инсулин нанобөлшектерінің жүктемесін айтарлықтай азайтады, себебі криопротектор салмақ қатынасының көп бөлігін алады. Сондықтан, өндірілген инсулин NP-лары инсулиннің терапиялық терезесіне жету үшін көп мөлшерде құрғақ нанобөлшектерді қажет ететіндіктен, көбінесе құрғақ ұнтақ формулаларын, мысалы, ішуге арналған таблеткалар мен ішуге арналған пленкаларды өндіруге жарамсыз болып табылады.
Бүріккіш кептіру - фармацевтика өнеркәсібінде сұйық фазалардан құрғақ ұнтақтарды алудың танымал және арзан өнеркәсіптік процесі10,11. Бөлшектердің түзілу процесін бақылау бірнеше биоактивті қосылыстардың 12, 13 дұрыс капсуляциялануына мүмкіндік береді. Сонымен қатар, ол ішуге арналған капсулаланған ақуыздарды дайындаудың тиімді әдісіне айналды. Бүріккіш кептіру кезінде су өте тез буланып кетеді, бұл бөлшектердің өзегінің температурасын төмен ұстауға көмектеседі11,14, бұл оны жылуға сезімтал компоненттерді капсуляциялау үшін қолдануға мүмкіндік береді. Бүріккіш кептірмес бұрын, жабын материалы капсулаланған ингредиенттері бар ерітіндімен мұқият гомогенделуі керек11,14. Мұздатып кептіруден айырмашылығы, бүріккіш кептіру кезінде капсулалау алдында гомогендеу сусыздандыру кезінде капсулалау тиімділігін арттырады. Бүріккіш кептіру процесі криопротекторларды қажет етпейтіндіктен, жоғары жүктемелі құрамы бар кептірілген NP алу үшін бүріккіш кептіруді пайдалануға болады.
Бұл зерттеуде иондық гель әдісін қолдана отырып, хитозан мен натрий триполифосфатын айқас байланыстыру арқылы инсулинмен толтырылған NP өндірісі туралы айтылады. Иондық гельдеу - белгілі бір жағдайларда екі немесе одан да көп иондық түрлер арасындағы электростатикалық өзара әрекеттесу арқылы нанобөлшектерді өндіруге мүмкіндік беретін дайындау әдісі. Оңтайландырылған хитозан/натрий триполифосфаты/инсулин айқас байланыстырылған нанобөлшектерін сусыздандыру үшін мұздатып кептіру және шашыратып кептіру әдістері қолданылды. Сусыздандырғаннан кейін олардың морфологиясы SEM арқылы талданды. Олардың рекомбинация қабілеті олардың өлшемдік таралуын, беттік зарядын, PDI, инкапсуляция тиімділігін және жүктеме мөлшерін өлшеу арқылы бағаланды. Әртүрлі сусыздандыру әдістерімен алынған қайта еріген нанобөлшектердің сапасы олардың инсулиннен қорғануын, босату мінез-құлқын және жасушалық сіңіру тиімділігін салыстыру арқылы да бағаланды.
Аралас ерітіндінің рН мәні және хитозан мен инсулиннің қатынасы соңғы NP бөлшектерінің өлшеміне және капсулалау тиімділігіне (EE) әсер ететін екі негізгі фактор болып табылады, себебі олар ионотропты гельдену процесіне тікелей әсер етеді. Аралас ерітіндінің рН мәні бөлшектердің өлшемімен және капсулалау тиімділігімен жоғары корреляцияланғаны көрсетілді (1a-сурет). 1a-суретте көрсетілгендей, рН 4,0-ден 6,0-ге дейін өскен сайын, бөлшектердің орташа өлшемі (нм) азайды және EE айтарлықтай өсті, ал рН 6,5-ке дейін өскен сайын, бөлшектердің орташа өлшемі арта бастады және EE өзгеріссіз қалды. Хитозанның инсулинге қатынасы артқан сайын, бөлшектердің орташа өлшемі де артады. Сонымен қатар, нанобөлшектер хитозан/инсулиннің массалық қатынасын 2,5:1-ден (салмақ/салмақ) жоғары дайындаған кезде EE өзгерісі байқалмады (1b-сурет). Сондықтан, осы зерттеудегі оңтайлы дайындау шарттары (рН 6,0, хитозан/инсулиннің массалық қатынасы 2,5:1) инсулинмен толтырылған нанобөлшектерді одан әрі зерттеу үшін дайындау үшін пайдаланылды. Осы дайындау жағдайында инсулин нанобөлшектерінің орташа бөлшектерінің өлшемі 318 нм-ге оңтайландырылды (1c-сурет), PDI 0,18, енгізу тиімділігі 99,4%, дзета потенциалы 9,8 мв және инсулин жүктемесі 25,01% (м/м) болды. Трансмиссиялық электронды микроскопия (TEM) нәтижелеріне сүйене отырып, оңтайландырылған нанобөлшектер шамамен сфералық және дискретті, салыстырмалы түрде біркелкі өлшемде болды (1d-сурет).
Инсулин нанобөлшектерін параметрлерді оңтайландыру: (a) рН-ның инсулин нанобөлшектерінің орташа диаметрі мен капсулалау тиімділігіне (EE) әсері (хитозан мен инсулиннің 5:1 массалық қатынасында дайындалған); (b) хитозан және инсулиннің массалық қатынасының инсулин NP-лерінің орташа диаметрі мен капсулалау тиімділігіне (EE) әсері (рН 6-да дайындалған); (c) оңтайландырылған инсулин нанобөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралуы; (d) оңтайландырылған инсулин NP-лерінің TEM микрографиясы.
Хитозанның рКа 6,5 болатын әлсіз полиэлектролит екені белгілі. Ол қышқыл ортада оң зарядталған, себебі оның негізгі амин тобы сутегі иондарымен протонданады15. Сондықтан ол көбінесе теріс зарядталған макромолекулаларды капсулалау үшін тасымалдаушы ретінде қолданылады. Бұл зерттеуде хитозан 5,3 изоэлектрлік нүктесі бар инсулинді капсулалау үшін қолданылды. Хитозан жабын материалы ретінде қолданылатындықтан, оның пропорциясының артуымен нанобөлшектердің сыртқы қабатының қалыңдығы сәйкесінше артады, бұл орташа бөлшектердің өлшемінің артуына әкеледі. Сонымен қатар, хитозанның жоғары деңгейі көбірек инсулинді капсулалай алады. Біздің жағдайда, хитозан мен инсулиннің қатынасы 2,5:1-ге жеткенде ЭЭ ең жоғары болды, ал қатынасы артып тұрғанда ЭЭ-де айтарлықтай өзгеріс болған жоқ.
Хитозан мен инсулиннің арақатынасынан басқа, рН NP дайындауда да маңызды рөл атқарды. Ган және т.б. 17 хитозан нанобөлшектерінің бөлшектерінің өлшеміне рН әсерін зерттеді. Олар рН 6,0-ге жеткенше бөлшектердің өлшемінің үздіксіз азаюын анықтады, ал рН > 6,0 кезінде бөлшектердің өлшемінің айтарлықтай артуы байқалды, бұл біздің бақылауларымызға сәйкес келеді. Бұл құбылыс рН жоғарылауымен инсулин молекуласы теріс беттік зарядқа ие болатындығына байланысты, осылайша хитозан/натрий триполифосфаты (TPP) кешенімен электростатикалық өзара әрекеттесуге ықпал етеді, бұл бөлшектердің өлшемінің кіші болуына және жоғары EE пайда болуына әкеледі. Дегенмен, рН 6,5-ке дейін реттелгенде, хитозандағы амин топтары депротондалып, хитозанның бүктелуіне әкелді. Осылайша, жоғары рН амин иондарының TPP мен инсулинге аз ұшырауына әкеледі, бұл көлденең байланыстың төмендеуіне, бөлшектердің орташа өлшемінің үлкен болуына және EE төмендеуіне әкеледі.
Лифролизденген және спреймен кептірілген NP-лердің морфологиялық қасиеттерін талдау сусыздандыру және ұнтақ түзу әдістерін таңдауға бағыт бере алады. Қолайлы әдіс дәрілік заттың тұрақтылығын, біркелкі бөлшектер пішінін, дәрілік заттың жоғары жүктемесін және бастапқы ерітіндіде жақсы ерігіштігін қамтамасыз етуі керек. Бұл зерттеуде екі әдісті жақсырақ салыстыру үшін сусыздандыру кезінде 1% маннитол қосылған немесе онсыз инсулин NP-лері қолданылды. Маннитол сусыздандыру және спреймен кептіру үшін әртүрлі құрғақ ұнтақ құрамдарында көлемді агент немесе криопротектор ретінде қолданылады. 2a-суретте көрсетілгендей, маннитолсыз лиофилизацияланған инсулин нанобөлшектері үшін сканерлеуші ​​электронды микроскопия (SEM) астында үлкен, біркелкі емес және кедір-бұдыр беттері бар жоғары кеуекті ұнтақ құрылымы байқалды. Сусыздандырудан кейін ұнтақтан бірнеше дискретті бөлшектер анықталды (2e-сурет). Бұл нәтижелер көптеген NP-лердің криопротекторсыз сусыздандыру кезінде ыдырағанын көрсетті. 1% маннитол бар сусыздандыру және спреймен кептірілген инсулин нанобөлшектері үшін тегіс беттері бар сфералық нанобөлшектер байқалды (1-сурет). 2b,d,f,h). Маннитолсыз шашыратып кептірілген инсулин нанобөлшектері сфералық болып қалды, бірақ бетінде әжімдер қалды (2c-сурет). Сфералық және әжімделген беттер төмендегі босату мінез-құлқы мен жасушалық сіңіру сынақтарында толығырақ талқыланады. Кептірілген NP-лердің көрінетін көрінісіне сүйене отырып, маннитолсыз шашыратып кептірілген NP-лер де, маннитолмен мұздатып кептірілген және шашыратып кептірілген NP-лер де ұсақ NP ұнтақтарын берді (2f,g,h-сурет). Бөлшектер беттері арасындағы беткі аудан неғұрлым үлкен болса, ерігіштігі соғұрлым жоғары болады және сондықтан босату жылдамдығы соғұрлым жоғары болады.
Әртүрлі кептірілген инсулин NP-лерінің морфологиясы: (a) маннитолсыз лиофилизацияланған инсулин NP-лерінің SEM кескіні; (b) маннитол қосылған лиофилизацияланған инсулин NP-лерінің SEM кескіні; (c) маннитолсыз шашыратып кептірілген инсулин NP-лерінің SEM кескіні; (d) маннитолмен шашыратып кептірілген инсулин NP-лерінің SEM кескіні; (e) маннитолсыз лиофилизацияланған инсулин NP-лерінің ұнтағының кескіні; (f) маннитол қосылған лиофилизацияланған инсулин NP-лерінің кескіні; (g) маннитолсыз шашыратып кептірілген инсулин NP-лерінің ұнтағының кескіні; (h) маннитол қосылған шашыратып кептірілген инсулин NP-лерінің ұнтағының кескіні.
Мұздатып кептіру кезінде маннитол криопротектор ретінде әрекет етеді, NP-лерді аморфты түрде сақтайды және мұз кристалдарының зақымдануын болдырмайды19. Керісінше, бүрку кезінде мұздату кезеңі жоқ. Сондықтан бұл әдісте маннитол қажет емес. Шын мәнінде, маннитолсыз бүрку арқылы кептірілген NP-лер бұрын сипатталғандай ұсақ NP-лерді берді. Дегенмен, маннитол бүрку арқылы кептіру процесінде толтырғыш ретінде әрекет ете алады, бұл NP-лерге сфералық құрылым береді20 (2d-сурет), бұл мұндай капсулаланған NP-лердің біркелкі босатылу мінез-құлқын алуға көмектеседі. Сонымен қатар, құрамында маннитол бар мұздатып кептірілген және бүрку арқылы кептірілген инсулин NP-лерінде кейбір ірі бөлшектерді анықтауға болатыны анық (2b,d-сурет), бұл бөлшектердің өзегінде капсулаланған инсулинмен бірге маннитолдың жиналуына байланысты болуы мүмкін. Хитозан қабатына. Айта кету керек, бұл зерттеуде сфералық құрылымның сусызданудан кейін сақталуын қамтамасыз ету үшін маннитол мен хитозанның қатынасы 5:1 деңгейінде сақталады, сондықтан көп мөлшерде толтырғыш кептірілген NP бөлшектерінің өлшемін де үлкейте алады.
Фурье түрлендіруімен инфрақызыл әлсіреген толық шағылысу (FTIR-ATR) спектроскопиясы бос инсулиннің, хитозанның, хитозанның, TPP және инсулиннің физикалық қоспасын сипаттады. Барлық кептірілген NP-лер FTIR-ATR спектроскопиясын қолдану арқылы сипатталды. Айта кету керек, маннитолмен мұздатып кептірілген капсулаланған NP-лерде және маннитолмен және онсыз шашыратып кептірілген NP-лерде 1641, 1543 және 1412 см-1 жолақ қарқындылығы байқалды (3-сурет). Бұрын хабарланғандай, беріктіктің бұл артуы хитозан, TPP және инсулин арасындағы айқас байланыспен байланысты болды. Хитозан мен инсулин арасындағы өзара әрекеттесуді зерттеу инсулинмен жүктелген хитозан нанобөлшектерінің FTIR спектрлерінде хитозан жолағы инсулинмен қабаттасып, карбонил қарқындылығын (1641 см-1) және амин (1543 см-1) белдеуін арттыратынын көрсетті. TPP триполифосфат топтары хитозандағы аммоний топтарымен байланысқан, 1412 см-1 аралығында жолақ түзеді.
Әртүрлі әдістермен сусыздандырылған бос инсулиннің, хитозанның, хитозан/TPP/инсулиннің физикалық қоспаларының және NP-лердің FTIR-ATR спектрлері.
Сонымен қатар, бұл нәтижелер SEM-де көрсетілген нәтижелерге сәйкес келеді, онда капсулаланған NP-лер маннитолмен бүркілгенде де, кептірілгенде де өзгеріссіз қалғаны, бірақ маннитол болмаған кезде тек бүркіп кептіру капсулаланған бөлшектерді түзгені көрсетілген. Керісінше, маннитолсыз кептірілген NP-лердің FTIR-ATR спектрлік нәтижелері хитозанның, TPP және инсулиннің физикалық қоспасына өте ұқсас болды. Бұл нәтиже хитозан, TPP және инсулин арасындағы көлденең байланыстардың маннитолсыз кептірілген NP-лерде енді жоқ екенін көрсетеді. NP құрылымы криопротекторсыз кептіру кезінде бұзылды, мұны SEM нәтижелерінен көруге болады (2a-сурет). Сусыздандырылған инсулин NP-лерінің морфологиясы мен FTIR нәтижелеріне сүйене отырып, маннитолсыз NP-лердің ыдырауына байланысты қалпына келтіру эксперименттері мен маннитолсыз NP-лер үшін тек лиофилизацияланған, бүркіп кептірілген және маннитолсыз NP-лер пайдаланылды. сусыздану. талқылау.
Сусыздандыру ұзақ мерзімді сақтау және басқа құрамдарға қайта өңдеу үшін қолданылады. Құрғақ NP-лардың сақтаудан кейін қалпына келу қабілеті оларды таблеткалар мен пленкалар сияқты әртүрлі құрамдарда қолдану үшін өте маңызды. Біз маннитол болмаған кезде шашыратып кептірілген инсулин NP-ларының орташа бөлшектерінің мөлшері қалпына келтіргеннен кейін аздап өскенін байқадық. Екінші жағынан, шашыратып кептірілген және мұздатып кептірілген инсулин нанобөлшектерінің маннитолмен бөлшектерінің мөлшері айтарлықтай өсті (1-кесте). Осы зерттеуде барлық NP-ларды рекомбинациялағаннан кейін PDI және EE айтарлықтай өзгерген жоқ (p > 0,05) (1-кесте). Бұл нәтиже бөлшектердің көпшілігі қайта ерігеннен кейін өзгеріссіз қалғанын көрсетеді. Дегенмен, маннитолды қосу лиофилизацияланған және шашыратып кептірілген маннитол нанобөлшектерінің инсулин жүктемесін айтарлықтай төмендетті (1-кесте). Керісінше, маннитолсыз шашыратып кептірілген NP-лардың инсулин жүктемесінің мөлшері бұрынғыдай қалды (1-кесте).
Дәрілік заттарды жеткізу мақсаттары үшін пайдаланылған кезде нанобөлшектерді жүктеу өте маңызды екені белгілі. Төмен жүктемесі бар NP үшін терапиялық шекті деңгейге жету үшін өте көп мөлшерде материал қажет. Дегенмен, мұндай жоғары NP концентрациясының жоғары тұтқырлығы ауызша қабылдауда және инъекциялық құрамдарда қолайсыздықтар мен қиындықтарға әкеледі 22. Сонымен қатар, инсулин NP-лерін таблеткалар мен тұтқыр биоүлбірлерді жасау үшін де пайдалануға болады 23, 24, бұл төмен жүктеме деңгейлерінде көп мөлшерде NP пайдалануды талап етеді, нәтижесінде ауызша қолдануға жарамсыз үлкен таблеткалар мен қалың биоүлбірлер пайда болады. Сондықтан, инсулин жүктемесі жоғары кептірілген NP-лер өте қажет. Біздің нәтижелеріміз маннитолсыз шашыратып кептірілген NP-лердің жоғары инсулин жүктемесі осы балама жеткізу әдістері үшін көптеген тартымды артықшылықтар бере алатынын көрсетеді.
Барлық кептірілген нанобөлшектер тоңазытқышта үш ай бойы сақталды. SEM нәтижелері барлық кептірілген нанобөлшектердің морфологиясы үш айлық сақтау кезінде айтарлықтай өзгермегенін көрсетті (4-сурет). Суда қалпына келтіргеннен кейін, барлық нанобөлшектер EE-нің аздап төмендеуін көрсетті және үш айлық сақтау кезеңінде шамамен аз мөлшерде (~5%) инсулин бөлді (2-кесте). Дегенмен, барлық нанобөлшектердің орташа бөлшектерінің өлшемі артты. Маннитолсыз шашыратып кептірілген нанобөлшектердің бөлшектерінің өлшемі 525 нм-ге дейін артты, ал маннитолмен шашыратып кептірілген және мұздатып кептірілген нанобөлшектердің бөлшектерінің өлшемі сәйкесінше 872 және 921 нм-ге дейін артты (2-кесте).
Үш ай бойы сақталған әртүрлі кептірілген инсулин NP-лерінің морфологиясы: (a) маннитол қосылған лиофилизацияланған инсулин NP-лерінің SEM кескіні; (b) маннитолсыз бүріккіш кептірілген инсулин нанобөлшектерінің SEM кескіні; (c) маннитолсыз бүріккіш кептірілген инсулин NP-лерінің SEM кескіндері.
Сонымен қатар, маннитолмен шашыратып кептіріліп, мұздатып кептірілген қалпына келтірілген инсулин нанобөлшектерінің тұнбалары байқалды (S2-сурет). Бұл үлкен бөлшектердің суда дұрыс суспензияланбауынан туындауы мүмкін. Жоғарыда келтірілген барлық нәтижелер шашыратып кептіру әдісі инсулин нанобөлшектерін сусызданудан қорғай алатынын және инсулин нанобөлшектерінің жоғары мөлшерін толтырғыштарсыз немесе криопротекторларсыз алуға болатынын көрсетеді.
Инсулиннің сақталуы сусызданудан кейін ферментативті ас қорытуға қарсы NP қорғаныс қабілетін көрсету үшін рН = 2,5 ортада пепсин, трипсин және α-химотрипсинмен тексерілді. Сусыздандырылған NP-лердің инсулиннің сақталуы жаңа дайындалған NP-лермен салыстырылды, ал бос инсулин теріс бақылау ретінде пайдаланылды. Бұл зерттеуде бос инсулин үш ферментативті өңдеудің барлығында 4 сағат ішінде инсулиннің тез жойылуын көрсетті (5a-c сурет). Керісінше, маннитолмен мұздатып кептірілген NP-лердің және маннитолмен немесе онсыз шашыратып кептірілген NP-лердің инсулинді жою сынағы бұл NP-лердің ферментативті ас қорытуға қарсы айтарлықтай жоғары қорғанысын көрсетті, бұл жаңа дайындалған инсулин NP-леріне ұқсас болды (1 сурет).5a-c). Пепсин, трипсин және α-химотрипсиндегі нанобөлшектердің көмегімен инсулиннің 50%, 60% және 75%-дан астамы сәйкесінше 4 сағат ішінде қорғалуы мүмкін (5a-c сурет). Бұл инсулинді қорғау қабілеті қанға инсулиннің жоғары сіңу мүмкіндігін арттыруы мүмкін25. Бұл нәтижелер маннитолмен немесе онсыз шашыратып кептіру және маннитолмен мұздатып кептіру сусызданудан кейін NP-лердің инсулинді қорғау қабілетін сақтай алатынын көрсетеді.
Сусыздандырылған инсулин NP-лерінің қорғанысы және босап шығуы: (a) пепсин ерітіндісіндегі инсулинді қорғау; (b) трипсин ерітіндісіндегі инсулинді қорғау; (c) инсулинді α-химотрипсин ерітіндісімен қорғау; (d) рН = 2,5 ерітіндісіндегі сусыздандырылған NP-лердің босап шығуы; (e) рН = 6,6 ерітіндісіндегі сусыздандырылған NP-лердің босап шығуы; (f) рН = 7,0 ерітіндісіндегі сусыздандырылған NP-лердің босап шығуы.
Жаңа дайындалған және қалпына келтірілген құрғақ инсулин NP-лары инсулиннің инсулинге төзімділікке әсерін зерттеу үшін асқазанның, он екі елі ішектің және аш ішектің жоғарғы бөлігінің рН ортасын модельдеу арқылы 37 °C температурада әртүрлі буферлерде (рН = 2,5, 6,6, 7,0) инкубацияланды. Әртүрлі ортадағы босату мінез-құлқы. Асқазан-ішек жолдарының фрагменті. рН = 2,5 кезінде инсулинмен толтырылған NP және қайта еріген құрғақ инсулин NP алғашқы бір сағат ішінде бастапқы жарылыс босатуды көрсетті, содан кейін келесі 5 сағат ішінде баяу босатылды (5d-сурет). Бастапқыда бұл жылдам босату, ең алдымен, бөлшектің ішкі құрылымында толық иммобилизацияланбаған ақуыз молекулаларының беткі десорбциясының нәтижесі болып табылады. рН = 6,5 кезінде инсулинмен толтырылған NP және қалпына келтірілген құрғақ инсулин NP 6 сағат ішінде тегіс және баяу босатуды көрсетті, себебі сынақ ерітіндісінің рН мәні NP дайындалған ерітіндінің рН-на ұқсас болды (5e-сурет). рН = 7 кезінде NP тұрақсыз болды және алғашқы екі сағат ішінде толығымен дерлік ыдырады (5f-сурет). Себебі хитозанның депротонациясы жоғары рН кезінде жүреді, бұл полимер желісінің аз тығыздалуына және жүктелген инсулиннің босатылуына әкеледі.
Сонымен қатар, маннитолсыз шашыратып кептірілген инсулин NP-лары басқа кептірілген NP-ларға қарағанда тезірек босап шығу профилін көрсетті (5d–f сурет). Бұрын сипатталғандай, маннитолсыз кептірілген қалпына келтірілген инсулин NP-лары ең кішкентай бөлшектердің өлшемін көрсетті. Кішкентай бөлшектер үлкен беттік аумақты қамтамасыз етеді, сондықтан тиісті препараттың көп бөлігі бөлшектердің бетінде немесе оған жақын болады, бұл препараттың тез босап шығуына әкеледі26.
NP-лердің цитоуыттылығы MTT талдауы арқылы зерттелді. S4 суретте көрсетілгендей, барлық кептірілген NP-лер 50-500 мкг/мл концентрациясында жасуша тіршілігіне айтарлықтай әсер етпейтіндігі анықталды, бұл барлық кептірілген NP-лерді терапиялық терезеге жету үшін қауіпсіз пайдалануға болатынын көрсетеді.
Бауыр - инсулиннің физиологиялық функцияларын орындайтын негізгі орган. HepG2 жасушалары - in vitro гепатоциттердің сіңіру моделі ретінде жиі қолданылатын адам гепатомасының жасушалық желісі. Мұнда HepG2 жасушалары мұздатып кептіру және бүріккіш кептіру әдістерін қолдана отырып, кептірілген NP жасушаларының жасушалық сіңірілуін бағалау үшін пайдаланылды. Ағынды цитометрияны және 25 мкг/мл концентрациясындағы бос FITC инсулинімен бірнеше сағаттық инкубациядан кейін көруді қолдана отырып, конфокальды лазерлік сканерлеу арқылы жасушалық сіңіру, жаңа дайындалған FITC инсулинмен толтырылған NP және тең инсулин концентрациясындағы кептірілген FITC инсулинмен толтырылған NP. Сандық микроскопия (CLSM) бақылаулары жүргізілді. Маннитолсыз лиофилизацияланған NP сусыздандыру кезінде жойылды және бұл сынақта бағаланбады. Жаңа дайындалған инсулинмен толтырылған NP, маннитолмен лиофилизацияланған NP және маннитолмен және маннитолсыз бүріккіш кептірілген NP жасушаішілік флуоресценция қарқындылығы (6a-сурет) 4,3 болды, бос инсулиндерге қарағанда 2,6, 2,4 және 4,1 есе жоғары. FITC-инсулин тобы, сәйкесінше (6b-сурет). Бұл нәтижелер капсулаланған инсулиннің жасушалық сіңіруде бос инсулинге қарағанда күштірек екенін көрсетеді, бұл негізінен зерттеуде алынған инсулинмен толтырылған нанобөлшектердің кішірек өлшеміне байланысты.
Жаңа дайындалған NP және кептірілген NP-лармен 4 сағаттық инкубациядан кейін HepG2 жасушаларының сіңуі: (a) HepG2 жасушаларының FITC-инсулин сіңуінің таралуы.(b) Ағынды цитометрия арқылы талданған флуоресценция қарқындылығының геометриялық орташа мәні (n = 3), бос инсулинмен салыстырғанда *P < 0,05.
Сол сияқты, CLSM кескіндері жаңа дайындалған FITC-инсулинмен толтырылған NP және FITC-инсулинмен толтырылған бүріккіш кептірілген NP (маннитолсыз) FITC флуоресценция қарқындылығы басқа үлгілерге қарағанда әлдеқайда күшті екенін көрсетті (6a-сурет). Сонымен қатар, маннитол қосылған кезде ерітіндінің жоғары тұтқырлығы жасушалардың сіңуіне төзімділікті арттырды, бұл инсулиннің көбеюінің төмендеуіне әкелді. Бұл нәтижелер маннитолсыз бүріккіш кептірілген NP жасушалардың ең жоғары сіңу тиімділігін көрсетті, себебі олардың бөлшектерінің мөлшері қайта ерігеннен кейін мұздатылған кептірілген NP-лерге қарағанда кішірек болды.
Хитозан (орташа молекулалық салмағы 100 кДа, 75–85% деацетилденген) Sigma-Aldrich компаниясынан (Оаквилл, Онтарио, Канада) сатып алынды. Натрий триполифосфаты (TPP) VWR компаниясынан (Раднор, Пенсильвания, АҚШ) сатып алынды. Бұл зерттеуде қолданылған рекомбинантты адам инсулині Fisher Scientific компаниясынан (Уолтхэм, Массачусетс, АҚШ) алынды. Флуоресцеин изотиоцианаты (FITC)-таңбаланған адам инсулині және 4′,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлориді (DAPI) Sigma-Aldrich компаниясынан (Оаквилл, Онтарио, Канада) сатып алынды. HepG2 жасуша желісі ATCC компаниясынан (Манассас, Вирджиния, АҚШ) алынды. Барлық басқа реагенттер аналитикалық немесе хроматографиялық дәрежеде болды.
1 мг/мл CS ерітіндісін 0,1% сірке қышқылы бар қос дистилденген суда (DD суында) еріту арқылы дайындаңыз. TPP және инсулиннің 1 мг/мл ерітінділерін DD суында және 0,1% сірке қышқылында еріту арқылы дайындаңыз. Алдын ала эмульсия политронды PCU-2-110 жоғары жылдамдықты гомогенизаторымен (Brinkmann Ind. Westbury, NY, АҚШ) дайындалды. Дайындау процесі келесідей: алдымен 4 мл инсулин ерітіндісіне 2 мл TPP ерітіндісі қосылады, қоспа 30 минут бойы араластырылып, толығымен араластырылады. Содан кейін аралас ерітінді шприц арқылы CS ерітіндісіне тамшылатып жоғары жылдамдықпен араластыру (10 000 айн/мин) кезінде қосылды. Қоспалар мұзды ваннада 30 минут бойы жоғары жылдамдықпен араластыру (15 000 айн/мин) кезінде ұсталды және көлденең байланысқан инсулин NP алу үшін белгілі бір рН мәніне келтірілді. Инсулин NP бөлшектерінің бөлшектерінің өлшемін одан әрі гомогендеу және азайту үшін олар... зонд типті ультрадыбыстық аппаратты (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Германия) пайдаланып мұзды ваннада қосымша 30 минут бойы ультрадыбыстық өңдеуден өткізілді.
Инсулин NPS 25°C температурада DD суында сұйылту арқылы Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрия) көмегімен динамикалық жарық шашырауы (DLS) өлшемдерін қолдана отырып, Z-орташа диаметрі, полидисперстілік индексі (PDI) және дзета потенциалы үшін сыналды. Морфологиясы мен өлшемінің таралуы Hitachi H7600 трансмиссиялық электронды микроскопымен (TEM) (Hitachi, Токио, Жапония) сипатталды, ал кескіндер кейіннен Hitachi бейнелеу бағдарламалық жасақтамасы (Hitachi, Токио, Жапония) арқылы талданды. Инсулин NP-лерінің инкапсуляция тиімділігін (EE) және жүктеме сыйымдылығын (LC) бағалау үшін NP-лер молекулалық салмақ шегі 100 кДа болатын ультрафильтрация түтіктеріне пипеткамен құйылып, 30 минут бойы 500 xg жылдамдықпен центрифугаланды. Фильтраттағы капсулаланбаған инсулин төрттік сорғыдан тұратын Agilent 1100 сериялы HPLC жүйесі (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, АҚШ) арқылы сандық анықталды. автоүлгілеуші, баған жылытқышы және DAD детекторы. Инсулин C18 бағанымен (Zorbax, 3,5 мкм, 4,6 мм × 150 мм, Agilent, АҚШ) талданды және 214 нм толқын ұзындығында анықталды. Жылжымалы фаза ацетонитрил және судан тұрды, құрамында 0,1% TFA бар, градиенттік қатынастары 10/90-нан 100/0-ге дейін және 10 минут бойы жұмыс істеді. Жылжымалы фаза 1,0 мл/мин ағын жылдамдығымен айдалды. Баған температурасы 20 °C-қа орнатылды. (1) және (2) теңдеулерін пайдаланып, EE және LC пайыздық үлесін есептеңіз.
Инсулин NP-ны оңтайландыру үшін 2,0-ден 4,0-ге дейінгі әртүрлі CS/инсулин қатынасы сыналды. Дайындау кезінде әртүрлі мөлшерде CS ерітіндісі қосылды, ал инсулин/TPP қоспасы тұрақты сақталды. Инсулин NP-лары барлық ерітінділерді (инсулин, TPP және CS) қосқаннан кейін қоспаның рН-ын мұқият бақылау арқылы 4,0-ден 6,5-ке дейінгі рН диапазонында дайындалды. Инсулин NP-ларының түзілуін оңтайландыру үшін инсулин нанобөлшектерінің EE және бөлшектердің өлшемі әртүрлі рН мәндерінде және CS/инсулин массасының қатынасында бағаланды.
Оңтайландырылған инсулин NP-лары алюминий контейнерге орналастырылып, скотчпен бекітілген тінмен жабылды. Кейіннен бұрандалы контейнерлер науа кептіргішімен жабдықталған Labconco FreeZone мұздатқыш кептіргішіне (Labconco, Канзас-Сити, Миссури, АҚШ) орналастырылды. Құрғақ инсулин NP-ларын алу үшін температура мен вакуум қысымы алғашқы 2 сағат ішінде -10 °C, 0,350 Торр, ал 24 сағаттың қалған 22 сағатында 0 °C және 0,120 Торр деңгейінде орнатылды.
Капсулаланған инсулин алу үшін Buchi B-290 Mini шашыратқыш кептіргіші (BÜCHI, Flawil, Швейцария) пайдаланылды. Таңдалған кептіру параметрлері: температура 100 °C, беру ағыны 3 л/мин және газ ағыны 4 л/мин болды.
Сусыздануға дейінгі және кейінгі инсулин NP-лары FTIR-ATR спектроскопиясын қолдану арқылы сипатталды. Сусыздандырылған нанобөлшектер, сондай-ақ бос инсулин мен хитозан әмбебап ATR іріктеу құралымен жабдықталған Spectrum 100 FTIR спектрофотометрін (PerkinElmer, Уолтхэм, Массачусетс, АҚШ) қолдану арқылы талданды (PerkinElmer, Уолтхэм, Массачусетс, АҚШ). Сигналдың орташа мәндері 4000-600 см2 жиілік диапазонында 4 см2 ажыратымдылықта 16 сканерлеуден алынды.
Құрғақ инсулин NP-лерінің морфологиясы Helios NanoLab 650 фокусталған иондық сәулелі сканерлеуші ​​​​электрондық микроскопымен (FIB-SEM) (FEI, Хиллсборо, Орегон, АҚШ) түсірілген мұздатылған және шашыратылған кептірілген инсулин NP-лерінің SEM кескіндері арқылы бағаланды. Қолданылған негізгі параметр кернеу 5 кэВ және ток 30 мА болды.
Барлық кептірілген инсулин NP-лары dd суда қайта ерітілді. Бөлшектердің өлшемі, PDI, EE және LC сусызданудан кейін олардың сапасын бағалау үшін бұрын айтылған әдісті қолдана отырып қайтадан сыналды. Ангидроинсулин NP-ларының тұрақтылығы ұзақ сақтаудан кейін NP-лардың қасиеттерін тексеру арқылы да өлшенді. Бұл зерттеуде сусызданудан кейінгі барлық NP-лар тоңазытқышта үш ай бойы сақталды. Үш ай сақтаудан кейін NP-лар морфологиялық бөлшектердің өлшемі, PDI, EE және LC бойынша сыналды.
Инсулиннің NP-ларды сусызданудан кейін қорғаудағы тиімділігін бағалау үшін 5 мл қалпына келтірілген NP-ларды 45 мл-де, құрамында симуляцияланған асқазан сұйықтығына (рН 1,2, құрамында 1% пепсин бар), ішек сұйықтығына (рН 6,8, құрамында 1% трипсин бар) немесе химотрипсин ерітіндісіне (100 г/мл, фосфат буферінде, рН 7,8) ерітіңіз. Олар 37°C температурада 100 айн/мин араластыру жылдамдығымен инкубацияланды. Әртүрлі уақыт нүктелерінде 500 мкл ерітінді жиналды және инсулин концентрациясы HPLC арқылы анықталды.
Жаңа дайындалған және кептірілген инсулин NP-ларының in vitro босату мінез-құлқы диализ пакеті әдісімен тексерілді (молекулалық салмақ шегі 100 кДа, Spectra Por Inc.). Жаңа дайындалған және қалпына келтірілген құрғақ NP-лар асқазанның, он екі елі ішектің және аш ішектің жоғарғы бөлігінің рН ортасын модельдеу үшін сәйкесінше рН 2,5, рН 6,6 және рН 7,0 (0,1 М фосфат-буферленген тұзды ерітінді, PBS) сұйықтықтарында диализденді. Барлық үлгілер 37°C температурада 200 айн/мин жылдамдықпен үздіксіз шайқау арқылы инкубацияланды. 5 мл диализ пакетінің сыртындағы сұйықтықты келесі уақытта сорып алыңыз: 0,5, 1, 2, 3, 4 және 6 сағат, және көлемді жаңа диализатпен дереу толтырыңыз. Сұйықтықтағы инсулиннің ластануы HPLC арқылы талданды, ал нанобөлшектерден инсулиннің босату жылдамдығы босатылған бос инсулиннің нанобөлшектерге капсулаланған жалпы инсулинге қатынасынан есептелді. (3-теңдеу).
Адамның гепатоцеллюлярлық карциномасының жасушалық желісі HepG2 жасушалары 10% ұрық ірі қарасының сарысуы, 100 ХБ/мл пенициллин және 100 мкг/мл стрептомицині бар Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) көмегімен диаметрі 60 мм ыдыстарда өсірілді29. Өсірулер 37°C температурада, 95% салыстырмалы ылғалдылықта және 5% CO2 температурада сақталды. Сіңіру талдаулары үшін HepG2 жасушалары 1 × 105 жасуша/мл мөлшерінде 8 ұяшықты Nunc Lab-Tek камералық слайд жүйесіне (Thermo Fisher, NY, АҚШ) себілді. Цитоуыттылық талдаулары үшін олар 96 ұяшықты пластиналарға (Corning, NY, АҚШ) 5 × 104 жасуша/мл тығыздықта себілді.
MTT талдауы жаңа дайындалған және кептірілген инсулин NPs30 цитоуыттылығын бағалау үшін қолданылды. HepG2 жасушалары 96 ұңғылы пластиналарға 5 × 104 жасуша/мл тығыздықта себіліп, сынақтан 7 күн бұрын өсірілді. Инсулин NPs өсірілетін ортада әртүрлі концентрацияларға (50-ден 500 мкг/мл-ге дейін) дейін сұйылтылып, содан кейін жасушаларға енгізілді. 24 сағаттық инкубациядан кейін жасушалар PBS-пен 3 рет жуылып, 0,5 мг/мл MTT бар ортада тағы 4 сағат бойы инкубацияланды. Цитотоксичность Tecan infinite M200 pro спектрофотометр пластинасын оқу құрылғысын (Tecan, Männedorf, Швейцария) пайдаланып, 570 нм толқын ұзындығында сары тетразолий MTT-нің күлгін формазанға ферментативті тотықсыздануын өлшеу арқылы бағаланды.
NP-лердің жасушалық сіңіру тиімділігі конфокальды лазерлік сканерлеу микроскопиясы және ағынды цитометрия талдауы арқылы тексерілді. Nunc Lab-Tek камералық слайд жүйесінің әрбір ұяшығы бос FITC-инсулинмен, FITC-инсулинмен жүктелген NP-лермен өңделді және 25 мкг/мл кептірілген FITC-инсулин NP-лері сол концентрацияда қалпына келтіріліп, 4 сағат бойы инкубацияланды. Жасушалар PBS-пен 3 рет жуылып, 4% параформальдегидпен бекітілді. Ядролар 4′,6-диамидино-2-фенилиндолмен (DAPI) боялды. Инсулиннің орналасуы Olympus FV1000 лазерлік сканерлеу/екі фотонды конфокальды микроскоп (Olympus, Синдзюку қаласы, Токио, Жапония) көмегімен байқалды. Ағынды цитометрия талдауы үшін 10 мкг/мл бос FITC-инсулин, FITC-инсулинмен жүктелген NP-лер және қайта ерітілген кептірілген NP-лердің бірдей концентрациялары анықталды. FITC-инсулин NP-лары HepG2 жасушалары себілген 96 ұяшықты пластиналарға қосылып, 4 сағат бойы инкубацияланды. 4 сағаттық инкубациядан кейін жасушалар алынып, FBS-пен 3 рет жуылды. Әр үлгідегі 5 × 104 жасуша BD LSR II ағынды цитометрімен (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, Америка Құрама Штаттары) талданды.
Барлық мәндер орташа ± стандартты ауытқу ретінде көрсетілген. Барлық топтар арасындағы салыстырулар Mac үшін IBM SPSS Statistics 26 (IBM, Endicott, Нью-Йорк, АҚШ) бағдарламасымен бір жақты ANOVA немесе t-тест арқылы бағаланды және p < 0,05 статистикалық тұрғыдан маңызды деп саналды.
Бұл зерттеу шашыратып кептірудің көлденең байланысқан хитозан/TPP/инсулин нанобөлшектерін сусыздандыруға икемділігі мен қабілетін көрсетеді, бұл көлемді агенттерді немесе криопротекторларды пайдаланатын стандартты мұздатып кептіру әдістерімен салыстырғанда жақсы қалпына келтіруге мүмкіндік береді және жоғары жүктеме сыйымдылығына ие. Оңтайландырылған инсулин нанобөлшектері орташа бөлшектердің өлшемін 318 нм және капсулалау тиімділігін 99,4% құрады. Сусыздандырудан кейінгі SEM және FTIR нәтижелері сфералық құрылым тек маннитолмен және маннитолсыз және маннитолмен лиофилизацияланған шашыратып кептірілген NP-лерде сақталғанын, бірақ маннитолсыз лиофилизацияланған NP-лер сусыздандыру кезінде ыдырағанын көрсетті. Қалпына келтіру қабілеті сынағында маннитолсыз шашыратып кептірілген инсулин нанобөлшектері ең аз орташа бөлшектердің өлшемін және қалпына келтіру кезінде ең жоғары жүктемені көрсетті. Барлық осы сусыздандырылған NP-лердің босату мінез-құлқы олардың рН = 2,5 және рН = 7 ерітінділерде тез босатылатынын және рН = 6,5 ерітіндісінде өте тұрақты екенін көрсетті. Басқа қайта ерітілген нанобөлшектермен салыстырғанда кептірілген NP-лерде, маннитолсыз шашыратып кептірілген NP-лер ең жылдам бөлінуді көрсетті. Бұл нәтиже жасушалық сіңіру сынағында байқалған нәтижеге сәйкес келеді, себебі маннитолсыз шашыратып кептірілген NP-лер жаңадан дайындалған NP-лердің жасушалық сіңіру тиімділігін толығымен дерлік сақтап қалды. Бұл нәтижелер маннитолсыз шашыратып кептіру арқылы дайындалған құрғақ инсулин нанобөлшектерінің басқа сусыз дәрілік формаларға, мысалы, ішуге арналған таблеткаларға немесе биоадгезивті пленкаларға одан әрі өңдеуге ең қолайлы екенін көрсетеді.
Зияткерлік меншік мәселелеріне байланысты, ағымдағы зерттеу барысында жасалған және/немесе талданған деректер жиынтығы көпшілікке қолжетімді емес, бірақ тиісті авторлардан ақылға қонымды сұраныс бойынша қолжетімді.
Каган, А. 2 типті қант диабеті: әлеуметтік және ғылыми шығу тегі, медициналық асқынулар және пациенттер мен басқалар үшін салдары. (McFarlane, 2009).
Сингх, А.П., Гуо, Ю., Сингх, А., Сие, В. және Цзян, П. Инсулинді капсулалаудың дамуы: қазір ішке қабылдау мүмкін бе? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Вонг, CY, Аль-Салами, Х. және Дасс, КР Қант диабетін емдеуге арналған пероральды инсулинмен толтырылған липосомаларды жеткізу жүйелеріндегі соңғы жетістіктер. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).