Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы нәтижелерге қол жеткізу үшін браузеріңіздің жаңа нұсқасын пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдеусіз немесе JavaScriptсіз көрсетіп жатырмыз.
Пропион қышқылы (ПҚҚ) аутизм спектрінің бұзылуы сияқты нейродаму бұзылыстарындағы митохондриялық дисфункцияның рөлін зерттеу үшін қолданылады. ПҚҚ митохондриялық биогенезді, метаболизмді және айналымды бұзатыны белгілі. Дегенмен, ПҚҚ митохондриялық динамикаға, бөлінуге және бірігуге әсері осы механизмдердің күрделі уақытша сипатына байланысты проблемалық болып қала береді. Мұнда біз ПҚҚ нейрон тәрізді SH-SY5Y жасушаларындағы митохондриялық ультрақұрылымға, морфологияға және динамикаға қалай әсер ететінін зерттеу үшін қосымша сандық бейнелеу әдістерін қолданамыз. ПҚҚ (5 мМ) митохондриялық ауданның (p < 0,01), Ферет диаметрі мен шеңберінің (p < 0,05) және 2 ауданның (p < 0,01) айтарлықтай төмендеуіне әкелді. Митохондриялық оқиға локаторын талдау бөліну және бірігу оқиғаларының айтарлықтай артуын (p < 0,05) көрсетті, осылайша стресс жағдайында митохондриялық желінің тұтастығын сақтайды. Сонымен қатар, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) және OPA1 (p < 0.05) мРНҚ экспрессиясы айтарлықтай төмендеді. 01). Бұл стресс жағдайында функцияны сақтау үшін митохондриялық морфологияның, биогенездің және динамиканың қайта құрылуын көрсетеді. Біздің деректеріміз PPA-ның митохондриялық динамикаға әсерін жаңаша түсінуге мүмкіндік береді және митохондриялық стресстік реакцияларға қатысатын күрделі реттеуші механизмдерді зерттеу үшін бейнелеу әдістерінің пайдалылығын көрсетеді.
Митохондриялық метаболизм энергия өндіру мен биосинтездегі әдеттегі рөлдерінен басқа әртүрлі жасушалық функциялардың ажырамас қатысушылары болып табылады. Митохондриялық метаболизм кальций сигнализациясының, метаболикалық және тотығу-тотықсыздану гомеостазының, қабыну сигнализациясының, эпигенетикалық модификациялардың, жасушалардың көбеюінің, дифференциациясының және бағдарламаланған жасуша өлімінің негізгі реттеушісі болып табылады1. Атап айтқанда, митохондриялық метаболизм нейрондық даму, тіршілік ету және функция үшін өте маңызды және нейропатологияның әртүрлі көріністерінде кеңінен қатысады2,3,4.
Соңғы онжылдықта метаболикалық мәртебе нейрогенездің, дифференциацияның, жетілудің және пластикалығының орталық реттеушісі ретінде пайда болды5,6. Жақында митохондриялық морфология мен динамика митоздың, жасушалар ішінде сау митохондриялық қорды сақтайтын динамикалық процесстің ерекше маңызды компоненттеріне айналды. Митохондриялық динамика митохондриялық биогенез бен биоэнергетикадан бастап митохондриялық бөлінуге, бірігуге, тасымалдауға және тазартуға дейінгі күрделі өзара тәуелді жолдармен реттеледі7,8. Осы интегративтік механизмдердің кез келгенінің бұзылуы сау митохондриялық желілердің сақталуына кедергі келтіреді және нейродаму үшін терең функционалдық салдарға әкеледі9,10. Шынында да, митохондриялық динамикасының бұзылуы көптеген психиатриялық, нейродегенеративті және нейродаму бұзылыстарында, соның ішінде аутизм спектрінің бұзылыстарында (АСБ) байқалады11,12.
АСД – күрделі генетикалық және эпигенетикалық архитектурасы бар гетерогенді нейродаму бұзылысы. АСД-ның тұқым қуалаушылығы даусыз, бірақ негізгі молекулалық этиологиясы әлі де нашар түсінілген. Клиникаға дейінгі модельдерден, клиникалық зерттеулерден және мультиомикалы молекулалық деректер жиынтығынан жинақталған деректер ASD13,14 митохондриялық дисфункциясының дәлелдерін арттырады. Біз бұрын АСД бар науқастардың когортасында геном бойынша ДНҚ метилдену скринингін жүргіздік және митохондриялық метаболикалық жолдар бойымен топтастырылған дифференциалды метилденген гендерді анықтадық15. Кейіннен біз митохондриялық биогенез бен динамикасының орталық реттегіштерінің дифференциалды метилденуі туралы хабарладық, бұл mtДНҚ көшірме санының артуымен және ASD16-да зәр метаболизмінің өзгеруімен байланысты болды. Біздің деректеріміз митохондриялық динамика мен гомеостаздың АСД патофизиологиясында орталық рөл атқаратынын дәлелдейтін дәлелдерді арттырады. Сондықтан, митохондриялық динамика, морфология және функция арасындағы байланысты механистік түсінуді жақсарту екінші реттік митохондриялық дисфункциямен сипатталатын неврологиялық ауруларды зерттеудің негізгі мақсаты болып табылады.
Молекулалық әдістер көбінесе митохондриялық стресстік реакциялардағы нақты гендердің рөлін зерттеу үшін қолданылады. Дегенмен, бұл тәсіл митоздық бақылау механизмдерінің көп қырлы және уақытша сипатымен шектелуі мүмкін. Сонымен қатар, митохондриялық гендердің дифференциалды экспрессиясы функционалдық өзгерістердің жанама көрсеткіші болып табылады, әсіресе әдетте тек шектеулі гендер саны талданатындықтан. Сондықтан митохондриялық функцияны және биоэнергетиканы зерттеудің тікелей әдістері ұсынылды17. Митохондриялық морфология митохондриялық динамикамен тығыз байланысты. Митохондриялық пішін, байланыс және құрылым энергия өндірісі, митохондриялық және жасушалық тіршілік үшін өте маңызды5,18. Сонымен қатар, митохондриялық морфологиядағы өзгерістерге назар аударылады, бұл митохондриялық дисфункцияның пайдалы соңғы нүктелері ретінде қызмет етуі және кейінгі механистік зерттеулер үшін негіз болуы мүмкін.
Митохондриялық морфологияны трансмиссиялық электронды микроскопия (ТЭМ) арқылы тікелей бақылауға болады, бұл жасушалық ультрақұрылымды егжей-тегжейлі зерттеуге мүмкіндік береді. ТЭМ митохондриялық кристалдардың морфологиясын, пішінін және құрылымын жеке митохондриялық резолюция кезінде тікелей бейнелейді, тек ген транскрипциясына, ақуыз экспрессиясына немесе жасуша популяцияларындағы митохондриялық функционалдық параметрлерге сүйенбейді17,19,20. Сонымен қатар, ТЭМ митохондриялық функция мен гомеостазда маңызды рөл атқаратын эндоплазмалық тор және аутофагосомалар сияқты басқа органеллалар арасындағы өзара әрекеттесуді зерттеуді жеңілдетеді21,22. Осылайша, бұл ТЭМ-ді белгілі бір жолдарға немесе гендерге назар аудармас бұрын митохондриялық дисфункцияны зерттеу үшін жақсы бастапқы нүктеге айналдырады. Митохондриялық функция нейропатология үшін барған сайын маңызды бола бастағандықтан, митохондриялық морфология мен динамиканы in vitro нейрондық модельдерде тікелей және сандық түрде зерттеу мүмкіндігінің айқын қажеттілігі бар.
Бұл мақалада біз аутизм спектрінің бұзылуы кезіндегі митохондриялық дисфункцияның нейрондық моделіндегі митохондриялық динамиканы қарастырамыз. Біз бұрын митохондриялық пропионил-КоА карбоксилаза ферментінің PCC суббірлігі болып табылатын ASD15-те пропионил-КоА карбоксилаза бета (PCCB) дифференциалды метилденуі туралы хабарлаған болатынбыз. PCC дисрегуляциясы пропион қышқылын (PPA) қоса алғанда, пропионил туындыларының уытты жинақталуын тудыратыны белгілі23,24,25. PPA нейрондық метаболизмді бұзатыны және in vivo мінез-құлықты өзгертетіні көрсетілген және ASD26,27,28-ге қатысатын нейродаму механизмдерін зерттеу үшін белгіленген жануарлар моделі болып табылады. Сонымен қатар, PPA митохондриялық мембраналық потенциалды, биогенезді және тыныс алуды in vitro бұзатыны туралы хабарланған және нейрондардағы митохондриялық дисфункцияны модельдеу үшін кеңінен қолданылған29,30. Дегенмен, PPA тудырған митохондриялық дисфункцияның митохондриялық морфология мен динамикаға әсері әлі күнге дейін толық түсінілмеген.
Бұл зерттеу SH-SY5Y жасушаларындағы митохондриялық морфологияға, динамикаға және функцияға PPA әсерін сандық бағалау үшін қосымша бейнелеу әдістерін қолданады. Біріншіден, біз митохондриялық морфология мен ультрақұрылымдағы өзгерістерді визуализациялау үшін TEM әдісін әзірледік17,31,32. Митохондриялықтың33 динамикалық сипатын ескере отырып, біз PPA стрессі кезінде бөліну және бірігу оқиғалары, митохондриялық саны мен көлемі арасындағы тепе-теңдіктегі өзгерістерді сандық бағалау үшін митохондриялық оқиға локализаторын (MEL) талдауды да қолдандық. Соңында, біз митохондриялық морфология мен динамика биогенезге, бөлінуге және бірігуге қатысатын гендердің экспрессиясындағы өзгерістермен байланысты ма екенін зерттедік. Жалпы алғанда, біздің деректеріміз митохондриялық динамиканы реттейтін механизмдердің күрделілігін анықтаудағы қиындықты көрсетеді. Біз SH-SY5Y жасушаларындағы митоздың өлшенетін конвергентті соңғы нүктесі ретінде митохондриялық морфологияны зерттеудегі TEM пайдалылығын атап өтеміз. Сонымен қатар, біз TEM деректері метаболикалық стресске жауап ретінде динамикалық оқиғаларды түсіретін бейнелеу әдістерімен үйлескенде ең бай ақпарат беретінін атап өтеміз. Нейрондық жасуша митозын қолдайтын молекулалық реттеу механизмдерін одан әрі сипаттау жүйке жүйесінің митохондриялық компоненті мен нейродегенеративті аурулар туралы маңызды түсінік бере алады.
Митохондриялық стрессті тудыру үшін SH-SY5Y жасушалары 3 мМ және 5 мМ натрий пропионаты (NaP) қолданылып, PPA-мен өңделді. TEM алдында үлгілер жоғары қысымды мұздату және мұздату арқылы криогенді үлгі дайындауға ұшырады (1a-сурет). Біз үш биологиялық қайталау арқылы митохондриялық популяциялардың сегіз морфологиялық параметрін өлшеу үшін автоматтандырылған митохондриялық кескін талдау құбырын жасадық. Біз PPA өңдеу төрт параметрді айтарлықтай өзгерткенін анықтадық: 2-аудан, аудан, периметр және Ферет диаметрі (1b-e-сурет). 2-аудан 3 мМ және 5 мМ PPA өңдеуімен айтарлықтай төмендеді (p = 0,0183 және p = 0,002 сәйкесінше) (1b-сурет), ал аудан (p = 0,003), периметр (p = 0,0106) және Ферет диаметрі айтарлықтай төмендеді. Бақылау тобымен салыстырғанда 5 мМ өңдеу тобында айтарлықтай төмендеу (p = 0,0172) байқалды (1c-e-сурет). Ауданы мен шеңберінің айтарлықтай азаюы 5 мМ PPA-мен өңделген жасушаларда митохондриялар кішірек, дөңгелектенген екенін және бұл митохондриялар бақылау жасушаларындағыға қарағанда азырақ созылғанын көрсетті. Бұл сондай-ақ бөлшектердің шеттері арасындағы ең үлкен қашықтықтың азаюын көрсететін тәуелсіз параметр - Ферет диаметрінің айтарлықтай төмендеуімен сәйкес келеді. Кристалардың ультрақұрылымындағы өзгерістер байқалды: кристалдар PPA стрессінің әсерінен онша айқын болмады (1a сурет, B панелі). Дегенмен, барлық суреттер кристалдардың ультрақұрылымын анық көрсете бермеді, сондықтан бұл өзгерістердің сандық талдауы жүргізілмеді. Бұл TEM деректері үш мүмкін сценарийді көрсетуі мүмкін: (1) PPA бөлінуді күшейтеді немесе бірігуді тежейді, бұл бар митохондриялардың өлшемінің кішіреюіне әкеледі; (2) биогенездің күшеюі жаңа, кішірек митохондриялар жасайды немесе (3) екі механизмді де бір уақытта индукциялайды. Бұл жағдайларды TEM арқылы ажырату мүмкін болмаса да, маңызды морфологиялық өзгерістер PPA стрессі кезінде митохондриялық гомеостаз бен динамикадағы өзгерістерді көрсетеді. Кейіннен біз бұл динамиканы және олардың негізінде жатқан ықтимал механизмдерді одан әрі сипаттау үшін қосымша параметрлерді зерттедік.
Пропион қышқылы (ПҚҚ) митохондриялық морфологияны қайта құрастырады. (a) ПҚҚ емінің артуымен митохондриялық өлшемнің азайып, митохондриялықтардың кішірейіп, дөңгелектенетінін көрсететін репрезентативті трансмиссиялық электронды микроскопия (ТЭМ) кескіндері; сәйкесінше 0 мМ (өңделмеген), 3 мМ және 5 мМ. Қызыл көрсеткілер митохондриялықтарды көрсетеді. (b–e) 24 сағат бойы ПҚҚ-мен өңделген SH-SY5Y жасушалары ТЭМ үшін дайындалды және нәтижелер Fiji/ImageJ көмегімен талданды. Сегіз параметрдің төртеуі бақылау (өңделмеген, 0 мМ ПҚҚ) және өңделген (3 мМ және 5 мМ ПҚҚ) жасушалар арасында айтарлықтай айырмашылықтарды көрсетті. (b) 2-аймақ, (c) Аудан, (d) Периметр, (e) Ферет диаметрі. Маңызды айырмашылықтарды анықтау үшін дисперсияның бір жақты талдауы (бақылау және емдеу) және Даннеттің көптік салыстыру сынағы қолданылды (p < 0,05). Деректер нүктелері әрбір жеке жасуша үшін орташа митохондриялық мәнді, ал қателік жолақтары орташа ± SEM мәнін білдіреді. Көрсетілген деректер n = 3 мәнін білдіреді, әр қайталауда кемінде 24 ұяшық бар; барлығы 266 кескін талданды; * p < 0,05 екенін, ** p < 0,01 екенін білдіреді.
Митохондриялық динамика PPA-ға қалай жауап беретінін одан әрі сипаттау үшін біз митохондриялықтарды тетраметилродамин этил эфирімен (TMRE) боядық және 3 және 5 мМ PPA-да 24 сағаттан кейін митохондриялықтарды локализациялау және сандық бағалау үшін уақытша микроскопия мен MEL талдауын қолдандық. Бөліну және бірігу оқиғаларын емдеу. (2a-сурет). MEL талдауынан кейін митохондриялық құрылымдардың санын және олардың орташа көлемін сандық бағалау үшін митохондриялықтар одан әрі талданды. Біз 3 мМ [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] кезінде болатын бөліну оқиғаларының санының аз, бірақ айтарлықтай өсуін байқадық, бұл бөліну [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)) және бірігу [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] және бірігу [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] <0,05)] оқиғаларымен салыстырғанда 5 мМ кезінде айтарлықтай өсті (3b-сурет). Митохондриялар саны 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] және 5 мМ [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] екеуінде де айтарлықтай өсті (3c-сурет), ал әрбір митохондриялық құрылымның орташа көлемі өзгеріссіз қалды (3c-сурет). 3d). Жалпы алғанда, бұл митохондриялық динамиканы қайта құру митохондриялық желінің тұтастығын сәтті сақтайтын компенсаторлық жауап ретінде қызмет ететінін көрсетеді. 3 мМ PPA кезінде бөліну оқиғалары санының артуы митохондриялық санның артуы ішінара митохондриялық бөлінуге байланысты екенін көрсетеді, бірақ митохондриялық орташа көлем іс жүзінде өзгеріссіз қалатынын ескере отырып, биогенезді қосымша компенсаторлық жауап ретінде жоққа шығаруға болмайды. Дегенмен, бұл деректер TEM байқаған кішірек, дөңгелек митохондриялық құрылымдармен сәйкес келеді және сонымен қатар PPA тудырған митохондриялық динамикадағы айтарлықтай өзгерістерді көрсетеді.
Пропион қышқылы (PPA) желінің тұтастығын сақтау үшін динамикалық митохондриялық қайта құруды тудырады. SH-SY5Y жасушалары өсіріліп, 24 сағат бойы 3 және 5 мМ PPA-мен өңделіп, TMRE және Hoechst 33342-мен боялды, содан кейін MEL талдауы жүргізілді. (a) Әр жағдай үшін 2-уақытта (t2) түрлі-түсті және екілік максималды қарқындылық проекцияларын бейнелейтін уақыт аралығының микроскопиялық кескіндері. Әрбір екілік кескінде көрсетілген таңдалған аймақтар уақыт бойынша динамиканы көрсету үшін үш түрлі уақыт аралығында (t1-t3) 3D форматында жақсартылып, көрсетіледі; бірігу оқиғалары жасыл түспен белгіленген; бөліну оқиғалары жасыл түспен белгіленген. Қызыл түспен көрсетілген. (b) Әр жағдайдағы динамикалық оқиғалардың орташа саны. (c) Әр жасушадағы митохондриялық құрылымдардың орташа саны. (d) Әр жасушадағы әрбір митохондриялық құрылымның орташа көлемі (µm3). Көрсетілген деректер емдеу тобына n = 15 жасушаны көрсетеді. Көрсетілген қателік жолақтары орташа ± SEM мәнін білдіреді, масштаб жолағы = 10 μm, * p < 0.05.
Пропион қышқылы (PPA) митохондриялық динамикамен байланысты гендердің транскрипциялық басылуын тудырады. SH-SY5Y жасушалары 24 сағат бойы 3 және 5 мМ PPA-мен өңделді. Гендердің салыстырмалы сандық бағалауы RT-qPCR көмегімен жүргізілді және B2M-ге дейін қалыпқа келтірілді. Митохондриялық биогенез гендерінің (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 және (d) NFE2L2. Митохондриялық бірігу және бөліну гендерінің (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 және (i) DRP1. Айтарлықтай айырмашылықтар (p < 0,05) бір жақты ANOVA (бақылау және емдеу) және Даннетттің көптік салыстыру сынағы арқылы тексерілді: * p < 0,05, ** p < 0,01 және **** p < 0,0001 көрсетеді. Жолақтар орташа экспрессияны ± SEM білдіреді. Көрсетілген деректер n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) және n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологиялық қайталануларын білдіреді.
TEM және MEL талдауларының деректері бірге PPA митохондриялық морфология мен динамиканы өзгертетінін көрсетеді. Дегенмен, бұл бейнелеу әдістері бұл процестерді басқаратын негізгі механизмдер туралы түсінік бермейді. Сондықтан біз PPA еміне жауап ретінде митохондриялық динамиканың, биогенездің және митоздың тоғыз негізгі реттегішінің мРНҚ экспрессиясын зерттедік. Біз жасуша миеломасының онкогенін (cMYC), ядролық тыныс алу факторын (NRF1), митохондриялық транскрипция факторы 1 (TFAM), NFE2 тәрізді транскрипция факторы BZIP (NFE2L2), гастрин тәрізді ақуыз 2 (STOML2), көру жүйкесінің атрофиясын 1 (OPA1), Митофусин 1 (MFN1), Митофусин 2 (MFN2) және динаминмен байланысты ақуыз 1 (DRP1) 24 сағаттан кейін 3 мМ және 5 мМ PPA-мен емдеуден кейін сандық түрде анықтадық. Біз 3 мМ (p = 0,0053, p = 0,0415 және p < 0,0001 сәйкесінше) және 5 мМ (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA емінің әсерін байқадық. (3a–c сурет). мРНҚ экспрессиясының төмендеуі дозаға тәуелді болды: cMYC, NRF1 және TFAM экспрессиясы 3 мМ кезінде сәйкесінше 5,7, 2,6 және 1,9 есеге, ал 5 мМ кезінде 11,2, 3 және 2,2 есеге төмендеді. Керісінше, орталық тотығу-тотықсыздану биогенезі гені NFE2L2 PPA кез келген концентрациясында өзгерген жоқ, дегенмен экспрессияның төмендеуінің дозаға тәуелді ұқсас үрдісі байқалды (3d сурет).
Біз сондай-ақ бөліну мен бірігуді реттеуге қатысатын классикалық гендердің экспрессиясын зерттедік. STOML2 бірігуге, митофагияға және биогенезге қатысады деп есептеледі және оның экспрессиясы 3 мМ (2,4 есе өзгеріс) және 5 мМ (2,8 есе өзгеріс) PPA-ға айтарлықтай төмендеді (p < 0,0001) (1-сурет). 3d-сурет). Сол сияқты, OPA1 бірігу генінің экспрессиясы 3 мМ (1,6 есе өзгеріс) және 5 мМ (1,9 есе өзгеріс) PPA-да (сәйкесінше p = 0,006 және p = 0,0024) төмендеді (3f-сурет). Дегенмен, біз 24 сағаттық PPA стрессі кезінде MFN1, MFN2 бірігу гендерінің немесе DRP1 бөліну генінің экспрессиясында айтарлықтай айырмашылықтарды таппадық (3g–i-сурет). Сонымен қатар, біз төрт бірігу және бөліну ақуыздарының (OPA1, MFN1, MFN2 және DRP1) деңгейлерінің бірдей жағдайларда өзгермегенін анықтадық (4a–d сурет). Бұл деректер уақыттың бір нүктесін көрсететінін және PPA стрессінің ерте кезеңдерінде ақуыз экспрессиясының немесе белсенділік деңгейлерінің өзгеруін көрсетпеуі мүмкін екенін атап өту маңызды. Дегенмен, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 және OPA1 экспрессиясының айтарлықтай төмендеуі митохондриялық метаболизмнің, биогенездің және динамиканың транскрипциялық дисрегуляциясының айтарлықтай бұзылуын көрсетеді. Сонымен қатар, бұл деректер митохондриялық функциядағы соңғы күйдегі өзгерістерді тікелей зерттеу үшін бейнелеу әдістерінің пайдалылығын көрсетеді.
Пропион қышқылымен (PPA) емдеуден кейін бірігу және бөліну факторы ақуызының деңгейі өзгерген жоқ. SH-SY5Y жасушалары 24 сағат бойы 3 және 5 мМ PPA-мен өңделді. Ақуыз деңгейі Western blot талдауы арқылы сандық түрде анықталды, ал экспрессия деңгейлері жалпы ақуызға дейін қалыпқа келтірілді. Орташа ақуыз экспрессиясы және нысана мен жалпы ақуыздың репрезентативті Western blotтары көрсетілген. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Жолақтар орташа ± SEM мәнін білдіреді, ал көрсетілген деректер n = 3 биологиялық қайталауларды білдіреді. Бірнеше салыстырулар (p < 0,05) бір жақты дисперсиялық талдау және Даннетт сынағы арқылы жүргізілді. Бастапқы гель мен блот S1 суретте көрсетілген.
Митохондриялық дисфункция метаболикалық, жүрек-қан тамырлары және бұлшықет ауруларынан бастап неврологиялық ауруларға дейінгі көп жүйелі аурулармен байланысты1,10. Көптеген нейродегенеративті және нейродегенеративті аурулар митохондриялық дисфункциямен байланысты, бұл мидың өмір сүру ұзақтығында осы органеллалардың маңыздылығын көрсетеді. Бұл ауруларға Паркинсон ауруы, Альцгеймер ауруы және ASD жатады3,4,18. Дегенмен, бұл ауруларды зерттеу үшін ми тініне қол жеткізу қиын, әсіресе механикалық деңгейде, бұл жасушалық модель жүйелерін қажетті балама етеді. Бұл зерттеуде біз нейрондық ауруларда, әсіресе аутизм спектрінің бұзылыстарында байқалатын митохондриялық дисфункцияны қайталау үшін PPA-мен өңделген SH-SY5Y жасушаларын пайдаланатын жасушалық модель жүйесін қолданамыз. Нейрондардағы митохондриялық динамиканы зерттеу үшін осы PPA моделін пайдалану ASD этиологиясын түсінуге мүмкіндік береді.
Біз митохондриялық морфологиядағы өзгерістерді көру үшін ТЭМ қолдану мүмкіндігін зерттедік. Тиімділігін арттыру үшін ТЭМ дұрыс қолданылуы керек екенін атап өту маңызды. Крио-үлгілерді дайындау жасушалық компоненттерді бір мезгілде бекіту және артефактілердің түзілуін азайту арқылы нейрондық құрылымдарды жақсы сақтауға мүмкіндік береді34. Осыған сәйкес, біз нейрон тәрізді SH-SY5Y жасушаларында жасушаішілік органеллалар мен созылған митохондриялар болғанын байқадық (1a-сурет). Бұл нейрондық жасуша модельдеріндегі митохондриялық морфологияны зерттеу үшін криогендік дайындау әдістерінің пайдалылығын көрсетеді. ТЭМ деректерін объективті талдау үшін сандық өлшеулер маңызды болғанымен, митохондриялық морфологиялық өзгерістерді растау үшін қандай нақты параметрлерді өлшеу керектігі туралы әлі де консенсус жоқ. Митохондриялық морфологияны сандық тұрғыдан зерттеген көптеген зерттеулерге сүйене отырып17,31,32, біз сегіз морфологиялық параметрді, атап айтқанда: аудан, аудан2, арақатынас, периметр, шеңберлік, дәреже, Ферет диаметрі және дөңгелектікті өлшейтін автоматтандырылған митохондриялық кескін талдау құбырын жасадық.
Олардың ішінде PPA 2-ші ауданды, ауданды, периметрді және Ферет диаметрін айтарлықтай азайтты (1b–e сурет). Бұл митохондриялардың кішірейіп, дөңгелектенгенін көрсетті, бұл PPA30 тудырған митохондриялық стресстің 72 сағатынан кейін митохондриялық ауданның азаюын көрсететін алдыңғы зерттеулерге сәйкес келеді. Бұл морфологиялық ерекшеліктер митохондриялық бөлінуді көрсетуі мүмкін, бұл зақымдалған компоненттерді митофагия арқылы деградацияны ілгерілету үшін митохондриялық желіден бөліп алу үшін қажетті процесс35,36,37. Екінші жағынан, митохондриялық орташа өлшемнің азаюы биогенездің жоғарылауымен байланысты болуы мүмкін, бұл кішкентай жаңадан пайда болған митохондриялардың пайда болуына әкеледі. Бөлінудің немесе биогенездің жоғарылауы митохондриялық стресске қарсы митозды сақтау үшін компенсаторлық жауапты білдіреді. Дегенмен, митохондриялық өсудің төмендеуін, бірігудің бұзылуын немесе басқа жағдайларды жоққа шығаруға болмайды.
TEM арқылы жасалған жоғары ажыратымдылықтағы кескіндер жеке митохондрия деңгейінде морфологиялық сипаттамаларды анықтауға мүмкіндік берсе де, бұл әдіс уақыттың бір нүктесінде екі өлшемді суреттерді жасайды. Метаболикалық стресске динамикалық реакцияларды зерттеу үшін біз митохондрияларды TMRE-мен боядық және MEL талдауы бар уақытша микроскопияны қолдандық, бұл уақыт өте келе митохондриялық желідегі өзгерістерді жоғары өнімді 3D визуализациялауға мүмкіндік береді33,38. Біз PPA стрессі кезінде митохондриялық динамикадағы нәзік, бірақ маңызды өзгерістерді байқадық (2-сурет). 3 мМ-де бөліну оқиғаларының саны айтарлықтай өсті, ал бірігу оқиғалары бақылаудағыдай қалды. 5 мМ PPA-да бөліну және бірігу оқиғаларының санының артуы байқалды, бірақ бұл өзгерістер шамамен пропорционалды болды, бұл бөліну мен бірігу кинетикасының жоғары концентрацияларда тепе-теңдікке жететінін көрсетеді (2b-сурет). Митохондриялық орташа көлем 3 және 5 мМ PPA-да өзгеріссіз қалды, бұл митохондриялық желінің тұтастығы сақталғанын көрсетеді (2d-сурет). Бұл динамикалық митохондриялық желілердің желінің фрагментациясын тудырмай гомеостазды тиімді ұстап тұру үшін жеңіл метаболикалық стресске жауап беру қабілетін көрсетеді. 3 мМ PPA кезінде бөлінудің артуы жаңа тепе-теңдікке көшуді ынталандыру үшін жеткілікті, бірақ PPA жоғары концентрациясынан туындаған стресске жауап ретінде тереңірек кинетикалық қайта құру қажет.
Митохондриялар саны екі PPA стресс концентрациясында да артты, бірақ митохондриялық орташа көлем айтарлықтай өзгерген жоқ (2c-сурет). Бұл биогенездің жоғарылауына немесе бөлінудің артуына байланысты болуы мүмкін; дегенмен, митохондриялық орташа көлемнің айтарлықтай төмендеуі болмаған жағдайда, биосинтездің артуы ықтимал. Дегенмен, 2-суреттегі деректер екі компенсаторлық механизмнің бар екенін растайды: митохондриялық бөлінудің жоғарылауымен сәйкес келетін бөліну оқиғалары санының артуы және митохондриялық биогенезбен сәйкес келетін оқиғалар санының артуы. Түптеп келгенде, жеңіл стресс үшін динамикалық компенсация бөлінуді, бірігуді, биогенезді және митофагияны қамтитын бір мезгілде жүретін процестерден тұруы мүмкін. Алдыңғы авторлар PPA митозды30,39 және митофагияны29 күшейтетінін көрсеткенімен, біз PPA-ға жауап ретінде митохондриялық бөліну мен бірігу динамикасын қайта құруға дәлелдер келтіреміз. Бұл деректер TEM байқаған морфологиялық өзгерістерді растайды және PPA тудырған митохондриялық дисфункциямен байланысты механизмдерді одан әрі түсінуге мүмкіндік береді.
TEM де, MEL де талдауы байқалған морфологиялық өзгерістердің негізінде жатқан гендік реттеу механизмдерінің тікелей дәлелдерін бермегендіктен, біз митохондриялық метаболизмге, биогенезге және динамикаға қатысатын гендердің РНҚ экспрессиясын зерттедік. cMYC протоонкогені - митохондриялық транскрипцияға, трансляцияға және кешенді жинауға қатысатын 600-ге жуық митохондриялық гендердің, соның ішінде NRF1 және TFAM41 экспрессиясын реттейтіні белгілі. NRF1 және TFAM - митохондриялық транскрипцияға, трансляцияға және кешенді жинауға қатысатын 600-ге жуық митохондриялық гендердің экспрессиясын реттейтіні белгілі, олар PGC-1α-дан төмен қарай әрекет етеді және мтДНҚ репликациясын белсендіреді. Бұл жол cAMP және AMPK сигнализациясы арқылы белсендіріледі және энергия шығыны мен метаболикалық стресске сезімтал. Біз сондай-ақ PPA әсерлерінің тотығу стрессімен байланысты болуы мүмкін екенін анықтау үшін митохондриялық биогенездің тотығу-тотықсыздану реттегіші NFE2L2-ні зерттедік.
NFE2L2 экспрессиясы өзгеріссіз қалғанымен, 3 мМ және 5 мМ PPA-мен 24 сағаттық емдеуден кейін cMYC, NRF1 және TFAM экспрессиясының дозаға тәуелді төмендеуін анықтадық (3a–c сурет). cMYC экспрессиясының төмендеуі бұрын митохондриялық стресске жауап ретінде хабарланған42, және керісінше, cMYC экспрессиясының төмендеуі митохондриялық метаболизмді, желілік байланысты және мембраналық поляризацияны қайта құру арқылы митохондриялық дисфункцияны тудыруы мүмкін43. Қызығы, cMYC митохондриялық бөліну мен бірігуді реттеуге де қатысады42,43 және жасуша бөлінуі кезінде DRP1 фосфорлануын және митохондриялық локализацияны арттыратыны белгілі44, сондай-ақ нейрондық бағаналы жасушаларда митохондриялық морфологиялық қайта құруды делдал етеді45. Шынында да, cMYC жетіспейтін фибробласттар PPA43 стрессінен туындаған өзгерістерге сәйкес митохондриялық өлшемнің азаюын көрсетеді. Бұл деректер cMYC мен митохондриялық динамика арасындағы қызықты, бірақ әлі белгісіз байланысты көрсетеді, бұл PPA стрессінен туындаған қайта құрудың болашақ зерттеулері үшін қызықты нысана болып табылады.
NRF1 және TFAM-ның азаюы cMYC-нің маңызды транскрипциялық активатор ретіндегі рөліне сәйкес келеді. Бұл деректер сондай-ақ адамның тоқ ішек қатерлі ісігі жасушаларында жүргізілген бұрынғы зерттеулерге сәйкес келеді, олар PPA 22 сағат ішінде NRF1 мРНҚ экспрессиясын төмендеткенін көрсетті, бұл АТФ-тың азаюымен және ROS46-ның жоғарылауымен байланысты болды. Бұл авторлар сонымен қатар TFAM экспрессиясының 8,5 сағаттан кейін жоғарылағанын, бірақ 22 сағаттан кейін бастапқы деңгейге оралғанын хабарлады. Керісінше, Ким және т.б. (2019) SH-SY5Y жасушаларында PPA стрессінің 4 сағатынан кейін TFAM мРНҚ экспрессиясының айтарлықтай төмендегенін көрсетті; дегенмен, 72 сағаттан кейін TFAM ақуыз экспрессиясы айтарлықтай артты және мтДНҚ көшірме саны айтарлықтай артты. Осылайша, 24 сағаттан кейін байқаған митохондриялық биогенез гендерінің санының азаюы митохондриялық санының артуы биогенездің ертерек уақыт нүктелерінде белсендірілуімен байланысты болуы мүмкін екенін жоққа шығармайды. Алдыңғы зерттеулер PPA SH-SY5Y жасушаларында PGC-1α мРНҚ мен ақуызды 4 сағат 30 минутта айтарлықтай жоғарылататынын көрсетті, ал пропион қышқылы бұзау гепатоциттеріндегі митохондриялық биогенезді PGC-1α арқылы 12 сағат 39 минутта күшейтеді. Қызығы, PGC-1α тек NRF1 және TFAM тікелей транскрипциялық реттегіші ғана емес, сонымен қатар бөліну мен бірігуді реттеу арқылы MFN2 және DRP1 белсенділігін реттейтіні көрсетілген47. Жалпы алғанда, бұл PPA тудыратын митохондриялық компенсаторлық реакцияларды реттейтін механизмдердің тығыз байланысын көрсетеді. Сонымен қатар, біздің деректеріміз PPA стрессі кезінде биогенез бен метаболизмнің транскрипциялық реттелуінің айтарлықтай бұзылуын көрсетеді.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 және DRP1 гендері митохондриялық бөлінудің, бірігуінің және динамикасының орталық реттегіштерінің қатарына жатады37,48,49. Митохондриялық динамикаға қатысатын басқа да көптеген гендер бар, дегенмен, STOML2, OPA1 және MFN2 бұрын ASD когорталарында дифференциалды түрде метилденгені анықталған,16 және бірнеше тәуелсіз зерттеулер митохондриялық стресске жауап ретінде осы транскрипция факторларының өзгерістері туралы хабарлады50,51.52. OPA1 және STOML2 экспрессиясы 3 мМ және 5 мМ PPA емімен айтарлықтай төмендеді (3e, f-сурет). OPA1 MFN1 және 2-мен тікелей әрекеттесу арқылы митохондриялық бірігудің классикалық реттегіштерінің бірі болып табылады және кристалдардың қайта құрылуында және митохондриялық морфологияда рөл атқарады53. STOML2-нің митохондриялық динамикадағы нақты рөлі әлі күнге дейін белгісіз, бірақ дәлелдер оның митохондриялық бірігуде, биогенезде және митофагияда рөл атқаратынын көрсетеді.
STOML2 митохондриялық тыныс алу байланысын сақтауға және тыныс алу тізбегі кешендерін қалыптастыруға қатысады54,55 және қатерлі ісік жасушаларының метаболикалық сипаттамаларын терең өзгертетіні көрсетілген56. Зерттеулер STOML2 BAN және кардиолипинмен өзара әрекеттесу арқылы митохондриялық мембраналық потенциал мен биогенезді ынталандыратынын көрсетті55, 57, 58. Сонымен қатар, тәуелсіз зерттеулер STOML2 мен PINK1 арасындағы өзара әрекеттесу митофагияны реттейтінін көрсетті59,60. Атап айтқанда, STOML2 MFN2-мен тікелей әрекеттесетіні және тұрақтандыратыны туралы хабарланған, сондай-ақ OPA1 ыдырауына жауапты протеазаны тежеу ​​арқылы OPA1 ұзын изоформаларын тұрақтандыруда маңызды рөл атқарады53,61,62. PPA реакцияларында байқалатын STOML2 экспрессиясының төмендеуі бұл бірігу ақуыздарын убиквитин және протеасомаға тәуелді жолдар арқылы ыдырауға сезімтал етуі мүмкін48. STOML2 және OPA1-дің PPA-ға динамикалық жауаптағы нақты рөлі белгісіз болса да, бұл бірігу гендерінің экспрессиясының төмендеуі (3-сурет) бөліну мен бірігу арасындағы тепе-теңдікті бұзуы және митохондриялық өлшемнің төмендеуіне әкелуі мүмкін (3-сурет). 1).
Екінші жағынан, OPA1 ақуызының экспрессиясы 24 сағаттан кейін өзгеріссіз қалды, ал MFN1, MFN2 немесе DRP1 мРНҚ және ақуыз деңгейлері PPA емінен кейін айтарлықтай өзгерген жоқ (3g-i сурет, 4-сурет). Бұл митохондриялық бірігу мен бөлінуге қатысатын осы факторлардың реттелуінде ешқандай өзгерістер жоқ екенін көрсетуі мүмкін. Дегенмен, осы төрт геннің әрқайсысы ақуыз белсенділігін басқаратын посттранскрипциялық модификациялармен (PTM) реттелетінін атап өткен жөн. OPA1 митохондриялық екі түрлі изоформаны 63 алу үшін протеолитикалық түрде бөлінетін сегіз балама сплайс нұсқаларына ие. Ұзын және қысқа изоформалар арасындағы тепе-теңдік сайып келгенде OPA1-дің митохондриялық бірігудегі және митохондриялық желіні сақтаудағы рөлін анықтайды64. DRP1 белсенділігі кальций/кальмодулинге тәуелді ақуыз киназа II (CaMKII) фосфорлануымен реттеледі, ал DRP1 ыдырауы убиквитиндену және SUMOylash арқылы реттеледі65. Соңында, DRP1 және MFN1/2 екеуі де GTPазалар болып табылады, сондықтан белсенділікке митохондриядағы GTP өндірісінің жылдамдығы әсер етуі мүмкін 66. Сондықтан, бұл ақуыздардың экспрессиясы тұрақты болып қалса да, бұл өзгермеген ақуыз белсенділігін немесе локализацияны көрсетпеуі мүмкін67,68. Шынында да, бар PTM ақуыз репертуарлары көбінесе жедел стресстік реакцияларды медиациялауға жауапты бірінші қорғаныс желісі ретінде қызмет етеді. Біздің модельде орташа метаболикалық стресс болған жағдайда, PTM митохондриялық тұтастықты мРНҚ немесе ақуыз деңгейінде қосымша белсендіруді қажет етпей, жеткілікті түрде қалпына келтіру үшін бірігу және бөліну ақуыздарының белсенділігінің артуына ықпал етеді.
Жоғарыда келтірілген деректер митохондриялық морфологияның күрделі және уақытқа тәуелді реттелуін және осы механизмдерді түсіндірудегі қиындықтарды көрсетеді. Ген экспрессиясын зерттеу үшін алдымен жолдағы нақты нысана гендерді анықтау қажет. Дегенмен, біздің деректеріміз бір жолдағы гендер бірдей стресске бірдей жауап бермейтінін көрсетеді. Шын мәнінде, бұрынғы зерттеулер бір жолдағы әртүрлі гендер әртүрлі уақытша жауап профильдерін көрсетуі мүмкін екенін көрсетті30,46. Сонымен қатар, транскрипция мен ген функциясы арасындағы байланысты бұзатын күрделі транскрипциядан кейінгі механизмдер бар. Протеомикалық зерттеулер PTM және ақуыз функциясының әсерін түсінуге мүмкіндік береді, бірақ олар сонымен қатар төмен өткізу қабілеті бар әдістер, жоғары сигнал-шу қатынасы және нашар ажыратымдылық сияқты қиындықтарды тудырады.
Осыған байланысты, TEM және MEL көмегімен митохондриялық морфологияны зерттеу митохондриялық динамика мен функция арасындағы байланыс және оның ауруға қалай әсер ететіні туралы негізгі сұрақтарды шешуге үлкен әлеуетке ие. Ең бастысы, TEM митохондриялық дисфункция мен динамикасының конвергентті соңғы нүктесі ретінде митохондриялық морфологияны өлшеудің тікелей әдісін ұсынады51. MEL сонымен қатар үш өлшемді жасушалық ортада бөліну және бірігу оқиғаларын визуализациялаудың тікелей әдісін ұсынады, бұл ген экспрессиясында өзгерістер болмаған кезде де динамикалық митохондриялық қайта құруды сандық бағалауға мүмкіндік береді33. Мұнда біз екінші реттік митохондриялық ауруларда митохондриялық бейнелеу әдістерінің пайдалылығын атап өтеміз. Бұл аурулар әдетте митохондриялық желілердің жедел зақымдануымен емес, нәзік қайта құруымен сипатталатын созылмалы жеңіл метаболикалық стресспен сипатталады. Дегенмен, созылмалы стресс жағдайында митозды сақтау үшін қажетті митохондриялық компенсацияның терең функционалдық салдары бар. Неврология тұрғысынан бұл компенсаторлық механизмдерді жақсы түсіну митохондриялық дисфункциямен байланысты плейотропты нейропатология туралы маңызды ақпарат бере алады.
Түптеп келгенде, біздің деректеріміз ген экспрессиясы, ақуыз модификациялары және нейрондық митохондриялық динамиканы басқаратын ақуыз белсенділігі арасындағы күрделі өзара әрекеттесудің функционалдық салдарын түсіну үшін бейнелеу әдістерінің пайдалылығын көрсетеді. Біз ASD митохондриялық компонентін түсіну үшін нейрондық жасуша моделіндегі митохондриялық дисфункцияны модельдеу үшін PPA қолдандық. PPA-мен өңделген SH-SY5Y жасушалары митохондриялық морфологияда өзгерістер көрсетті: митохондриялық кішірейіп, дөңгелектенді, ал TEM арқылы байқалған кезде кристалдар нашар анықталды. MEL талдауы бұл өзгерістердің жеңіл метаболикалық стресске жауап ретінде митохондриялық желіні сақтау үшін бөліну және бірігу оқиғаларының артуымен қатар жүретінін көрсетеді. Сонымен қатар, PPA митохондриялық метаболизм мен гомеостаздың транскрипциялық реттелуін айтарлықтай бұзады. Біз cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 және OPA1-ді PPA стрессімен бұзылатын негізгі митохондриялық реттегіштер ретінде анықтадық және митохондриялық морфология мен функциядағы PPA тудырған өзгерістерді медиациялауда рөл атқаруы мүмкін. Ген экспрессиясы мен ақуыз белсенділігіндегі, локализациядағы және трансляциядан кейінгі модификациялардағы PPA тудырған уақытша өзгерістерді жақсы сипаттау үшін болашақ зерттеулер қажет. Біздің деректеріміз митохондриялық стресстік реакцияны реттейтін реттеуші механизмдердің күрделілігі мен өзара тәуелділігін көрсетеді және TEM және басқа да бейнелеу әдістерінің мақсатты механистік зерттеулер үшін пайдалылығын көрсетеді.
SH-SY5Y жасуша желісі (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich компаниясынан сатып алынды. SH-SY5Y жасушалары Dulbecco компаниясының модификацияланған Eagle's ортасы/F-12 қоректік қоспасында (DMEM/F-12) және L-глутаминінде (SC09411, ScienCell) 25 см2 колбаларда 20% ұрық сиырының сарысуымен (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) және 1% пенициллин-стрептомицинмен (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) 37 °C температурада, 5% CO2 кезінде өсірілді. Жасушалар 0,05% трипсин-ЭДТА (15400054, ThermoFisher Scientific) көмегімен 80% қосылысқа дейін субкультураланды, 300 г-да центрифугаланды және шамамен 7 × 105 жасуша/мл тығыздықта жабысып алынды. Барлық тәжірибелер 19-22 өткелдер арасындағы дифференциалданбаған SH-SY5Y жасушаларында жүргізілді. PPA NaP ретінде енгізіледі. NaP ұнтағын (CAS № 137-40-6, химиялық формуласы C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) жылы MilliQ суда 1 М концентрациясына дейін ерітіп, 4°C температурада сақтаңыз. Емдеу күні бұл ерітіндіні 1 М PPA-мен 3 мМ және 5 мМ PPA-ға дейін сарысусыз ортада (L-глутамин қосылған DMEM/F-12) сұйылтыңыз. Барлық тәжірибелер үшін емдеу концентрациялары PPA (0 мМ, бақылау), 3 мМ және 5 мМ PPA болды. Тәжірибелер кем дегенде үш биологиялық қайталауда жүргізілді.
SH-SY5Y жасушалары 25 см5 колбаларға 5,5 × 105 жасуша/мл жылдамдықпен себіліп, 24 сағат бойы өсірілді. PPA өңдеуі колбаға 24 сағат инкубация алдында қосылды. Жасуша түйіршіктерін сүтқоректілер тіндерінің қалыпты субкультура хаттамаларына сәйкес жинаңыз (жоғарыда сипатталған). Жасуша түйіршіктерін 100 мкл 2,5% глутаральдегид, 1× PBS ерітіндісінде қайта ерітіп, өңделгенше 4°C температурада сақтаңыз. SH-SY5Y жасушалары жасушаларды түйіршіктеп, 2,5% глутаральдегид, 1× PBS ерітіндісін алу үшін қысқа уақытқа центрифугаланды. Шөгіндіні дистилденген суда дайындалған 4% агароза гелінде қайта ерітіңіз (агарозаның шөгінді көлеміне қатынасы 1:1). Агароза бөліктері жалпақ пластиналардағы торларға орналастырылып, жоғары қысымды мұздатудан бұрын 1-гексадеценмен жабылды. Үлгілер 100% құрғақ ацетонда -90°C температурада 24 сағат бойы мұздатылды. Содан кейін температура -80°C дейін көтеріліп, 1% осмий тетроксиді мен 0,1% глутаральдегид ерітіндісі қосылды. Үлгілер -80°C температурада 24 сағат бойы сақталды. Осыдан кейін температура бірнеше күн бойы біртіндеп бөлме температурасына дейін көтерілді: 24 сағат бойы – 80 °C-тан – 50 °C-қа дейін, 24 сағат бойы – 30 °C-қа дейін, 24 сағат бойы – 10 °C-қа дейін және соңында бөлме температурасына дейін.
Криогендік дайындықтан кейін үлгілер шайырмен сіңдіріліп, Leica Reichert UltracutS ультрамикротомын (Leica Microsystems) пайдаланып ультражұқа кесінділер (∼100 нм) жасалды. Кесіндтер 2% уранил ацетаты және қорғасын цитратымен боялды. Үлгілер 200 кВ кернеуде жұмыс істейтін FEI Tecnai 20 беріліс электронды микроскопын (ThermoFisher (бұрынғы FEI), Эйндховен, Нидерланды) және Tridiem энергия сүзгісімен жабдықталған Gatan CCD камерасын (Gatan, Ұлыбритания) пайдаланып бақыланды.
Әрбір техникалық қайталауда кемінде 24 жеке жасуша кескіні алынды, барлығы 266 кескін. Барлық кескіндер Қызығушылық аймағы (ROI) макросы және Митохондрия макросы арқылы талданды. Митохондриялық макро жарияланған әдістерге негізделген17,31,32 және Fiji/ImageJ69-да TEM кескіндерін жартылай автоматтандырылған топтық өңдеуге мүмкіндік береді. Қысқаша айтқанда: кескін домалақ шарлы фондық азайту (60 пиксель радиусы) және FFT жолақты өткізу сүзгісі (сәйкесінше 60 және 8 пиксель жоғарғы және төменгі шекараларды пайдалану) және 5% бағдарлау төзімділігімен тік сызықты басу арқылы төңкеріледі және төңкеріледі. Өңделген кескін максималды энтропия алгоритмін пайдаланып автоматты түрде шекті мәнге қойылады және екілік маска жасалады. Шикі TEM кескіндерінде қолмен таңдалған ROI-мен байланысты кескін аймақтары алынып, митохондрияны сипаттайды және плазмалық мембрана мен басқа да жоғары контрастты аймақтар алынып тасталады. Әрбір алынған ROI үшін 600 пиксельден асатын екілік бөлшектер талданды, ал бөлшектердің ауданы, периметрі, үлкен және кіші осьтері, Ферет диаметрі, дөңгелектігі және шеңберлігі Fiji/ImageJ кірістірілген өлшеу функцияларын пайдаланып өлшенді. Merrill, Flippo және Strack (2017) бойынша, 2-ші аудан, бөлшектердің аспект қатынасы (үлкен оське қатынасы) және пішін факторы (FF) осы деректерден есептелді, мұндағы FF = периметр 2/4pi x аудан. Параметрлік формуланың анықтамасын Merrill, Flippo және Strack (2017)-ден табуға болады. Аталған макростар GitHub-та қолжетімді (Деректердің қолжетімділігі туралы мәлімдемені қараңыз). Орташа есеппен PPA өңдеуіне шамамен 5600 бөлшектер талданды, барлығы шамамен 17000 бөлшектер (деректер көрсетілмеген).
SH-SH5Y жасушалары түні бойы адгезияны қамтамасыз ету үшін 8 камералы дақыл ыдыстарына (ThermoFisher, #155411) орналастырылды, содан кейін TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) және Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) бояуымен инкубацияланды. Кескіндер 10 минуттық ортада 405 нм және 561 нм лазерлерді қолдану арқылы алынды, ал шикі кескіндер келесі 12 уақыт нүктесінде кескін кадрлары арасында 0,2 мкм аз қадаммен 10 кескін микрографиясын қамтитын z-стектері ретінде алынды. Кескіндер Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 супер ажыратымдылық платформасын (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия) пайдаланып LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 линзасын пайдаланып жиналды. Суреттер ImageJ бағдарламасында бұрын сипатталған құбыржол және ImageJ плагині арқылы талданып, бірігу және бөліну оқиғаларын, митохондриялық құрылымдардың орташа санын және жасушаға шаққандағы орташа митохондриялық көлемді өлшеді33. MEL макростары GitHub сайтында қолжетімді (Деректердің қолжетімділігі туралы мәлімдемені қараңыз).
SH-SY5Y жасушалары емдеуден 24 сағат бұрын алты ұяшықты пластиналарда 0,3 × 106 жасуша/мл тығыздықта өсірілді. РНҚ Quick-RNA™ Miniprep хаттамасын (ZR R1055, Zymo Research) пайдаланып аздаған өзгертулермен бөлініп алынды: алып тастамас бұрын әрбір ұяшыққа 300 мкл РНҚ лизис буферін қосыңыз және әрбір үлгіні соңғы қадам ретінде 30 мкл DNase/RNase элюциясымен лизиске ұшыратыңыз. -сыз су. Барлық үлгілер саны мен сапасы NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометрін пайдаланып тексерілді. Жасуша лизаттарынан алынған жалпы ақуыз 200 мкл RIPA лизис буферін пайдаланып алынды, ал ақуыз концентрациясы Bradford ақуыз талдауын пайдаланып сандық анықталды70.
кДНҚ синтезі өндірушінің нұсқауларына сәйкес, кейбір өзгертулермен Tetro™ кДНҚ синтез жинағын (BIO-65043, Meridian Bioscience) пайдаланып жүргізілді. кДНҚ 20 мкл реакцияларда жалпы РНҚ-ның 0,7-ден 1 мкг-ға дейін мөлшерін пайдаланып синтезделді. Праймерлер бұрын жарияланған 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 мақалаларынан (S1 кестесі) таңдалды және ілеспе зондтар Integrated DNA Technologies компаниясының PrimerQuest құралын пайдаланып жасалды. Барлық қызығушылық тудыратын гендер ядролық B2M геніне қалыпқа келтірілді. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC және OPA1 ген экспрессиясы RT-qPCR арқылы өлшенді. Негізгі қоспаға LUNA Taq полимеразасы (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ алға және кері праймерлері, кДНҚ және ПТР-дәрежелі су кірді, бұл әрбір реакция үшін 10 мкл соңғы көлемді алу үшін жасалды. Бөліну және бөліну гендерінің экспрессиясы (DRP1, MFN1/2) TaqMan мультиплексті талдауларын қолдану арқылы өлшенді. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) өндірушінің нұсқауларына сәйкес аздаған өзгерістермен пайдаланылды. Мультиплексті RT-qPCR негізгі қоспасына 1X LUNA Taq полимеразасы, 10 мкМ алға және кері праймерлері, 10 мкМ зонд, кДНҚ және ПТР-дәрежелі су кіреді, нәтижесінде әрбір реакция үшін 20 мкл соңғы көлем алынды. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—сериялық нөмірі: R0618110) көмегімен орындалды. Циклдік жағдайлар S1 кестесінде көрсетілген. Барлық кДНҚ үлгілері үш есе көбейтілді және он есе сұйылту сериясын қолдану арқылы стандартты қисық жасалды. Цикл шегі стандартты ауытқуы (Ct) >0,5 болатын үш еселенген үлгілердегі ауытқулар деректердің қайталануын қамтамасыз ету үшін талдаудан алынып тасталды30,72. Салыстырмалы ген экспрессиясы 2-ΔΔCt79 әдісін қолдану арқылы есептелді.
Ақуыз үлгілері (60 мкг) Laemmli жүктеу буферімен 2:1 қатынасында араластырылып, 12% түссіз ақуыз гелінде (Bio-Rad #1610184) іске қосылды. Ақуыздар Trans-Blot Turbo жүйесін (#170-4155, Bio-Rad) пайдаланып PVDF (поливинилиден фториді) мембранасына (#170-84156, Bio-Rad) ауыстырылды. Мембрана бұғатталып, тиісті бастапқы антиденелермен (OPA1, MFN1, MFN2 және DRP1) 48 сағат бойы инкубацияланды (1:1000 сұйылтылған), содан кейін 1 сағат бойы екінші реттік антиденелермен (1:10,000) инкубацияланды. Содан кейін мембраналар Clarity Western ECL субстраты (#170-5061, Bio-Rad) көмегімен бейнеленді және Bio-Rad ChemiDoc MP жүйесі арқылы жазылды. Western blot талдауы үшін ImageLab 6.1 нұсқасы пайдаланылды. Бастапқы гель мен дақ S1 суретте көрсетілген. Антиденелер туралы ақпарат S2 кестесінде берілген.
Деректер жиынтығы кем дегенде үш тәуелсіз үлгінің орташа мәні және орташа мәннің стандартты қателігі (SEM) ретінде ұсынылған. Деректер жиынтығы Гаусс үлестірімі мен тең стандартты ауытқуларды қабылдамас бұрын және талдауларды жалғастырмас бұрын Шапиро-Уилкс сынағын (басқаша көрсетілмесе) пайдаланып қалыптылыққа тексерілді. Маңыздылықты анықтау үшін деректер жиынтығын Фишердің MEL LSD (p < 0,05), бір жақты ANOVA (емдеу және бақылау орташасы) және Даннеттің көптік салыстыру сынағын (p < 0,05) пайдаланып талдаудан басқа. Маңызды p мәндері графикте *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 ретінде көрсетілген. Барлық статистикалық талдаулар мен графиктер GraphPad Prism 9.4.0 көмегімен орындалды және жасалды.
TEM кескіндерін талдауға арналған Fiji/ImageJ макростары GitHub сайтында жалпыға қолжетімді: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Митохондриялық оқиға локаторы (MEL) макросы GitHub сайтында жалпыға қолжетімді: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. және Виджая А. Митохондриялар: метаболизмнің, гомеостаздың, стресстің, қартаюдың және эпигенетиканың негізгі реттегіштері. Индонезиялық. Биомедициналық ғылым. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шизофрениядағы көп қырлы митохондриялық дисфункция, I кешені мүмкін патологиялық нысана ретінде. Шизофрения. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. және Бил, М.Ф. Паркинсон ауруындағы митохондриялық дисфункция. Нейрохимия журналы. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сингх Т.Г. және Мехта В. Стресске ұшыраған митохондриялар: Альцгеймер ауруындағы инвазия нысандары. Митохондриялар 59, 48–57 (2021).
Беленгуэр П., Дуарте Дж.М.Н., Шук П.Ф. және Феррейра Г.К. Митохондриялар және ми: биоэнергетика және т.б. Нейротоксиндер. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангаражу, В. және т.б. Плейотропты митохондриялар: митохондриялардың нейрондық даму мен ауруға әсері. J. ​​Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. және Morais, VA Нейрондардағы митохондриялық биогенез: қалай және қайда. халықаралық. Дж. Мор. ғылым. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Нистер, М. және Чжао, Дж. Сүтқоректілердің митохондриялық динамикасын реттеу: мүмкіндіктер мен қиындықтар. алдыңғы. эндокриндік. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. және Слэк, РС Нейрогенезді реттеудегі митохондриялық динамикасы: дамушыдан ересек миға дейін. даму. динамикалық. 247, 47–53 (2018).