Қазіргі *Ағымдағы мекенжайы: Кёльн 50931, Германия, Қартаюға байланысты аурулардағы жасушалық стресске жауап беру бойынша Кёльннің үздік кластерлік зерттеуі (CECAD).
Митохондриялық аурулардың нейродегенерациясы қайтымсыз болып саналады, себебі нейрондардың метаболикалық пластикасы шектеулі, бірақ митохондриялық дисфункцияның организмдегі нейрондық метаболизмнің жасушалық автономиясына әсері нашар түсінілген. Мұнда біз митохондриялық бірігу динамикасы бұзылғаннан туындаған прогрессивті OXPHOS жетіспеушілігі бар Пуркинье нейрондарының жасушаға тән протеомасын ұсынамыз. Біз митохондриялық дисфункция протеомика саласында терең өзгеріс тудырғанын анықтадық, бұл сайып келгенде жасуша өліміне дейін дәл метаболикалық бағдарламалардың тізбекті белсендірілуіне әкелді. Күтпеген жерден біз пируват карбоксилазасының (PCx) және TCA циклінің аралық өнімдерін толықтыратын басқа қартаюға қарсы ферменттердің айқын индукциясын анықтадық. PCx тежелуі тотығу стрессі мен нейродегенерацияны күшейтті, бұл атеросклероздың OXPHOS жетіспейтін нейрондарда қорғаныс әсері бар екенін көрсетеді. Терминалды дегенерацияланған нейрондарда митохондриялық бірігуді қалпына келтіру бұл метаболикалық сипаттамаларды толығымен өзгертеді, осылайша жасуша өлімінің алдын алады. Біздің зерттеу нәтижелеріміз митохондриялық дисфункцияға төзімділік беретін бұрын белгісіз жолдарды анықтайды және нейродегенерацияны аурудың соңғы кезеңдерінде де қалпына келтіруге болатынын көрсетеді.
Митохондриялық энергия алмасуын сақтаудағы митохондриялықтардың орталық рөлі адам митохондриялық ауруларымен байланысты кең ауқымды неврологиялық симптомдармен айқындалады. Бұл аурулардың көпшілігі митохондриялық ген экспрессиясын реттейтін ген мутацияларынан (1, 2) немесе митохондриялық динамикамен байланысты гендердің бұзылуынан туындайды, бұл митохондриялық ДНҚ-ның (мтДНҚ) тұрақтылығына жанама түрде әсер етеді (3, 4). Жануарлар модельдеріндегі жұмыс қоршаған тіндердегі митохондриялық дисфункцияға жауап ретінде консервативті метаболикалық жолдарды (5-7) белсендіруге болатынын көрсетті, бұл осы күрделі аурулардың патогенезін терең түсіну үшін маңызды ақпарат береді. Керісінше, ми митохондриялық аденозин трифосфаты (АТФ) өндірісінің жалпы сәтсіздігінен туындаған белгілі бір жасуша түрлерінің метаболикалық өзгерістерін түсінуіміз негізгі болып табылады (8), бұл аурудың алдын алу немесе болдырмау үшін пайдаланылуы мүмкін терапиялық мақсаттарды анықтау қажеттілігін атап көрсетеді. Нейродегенерацияның алдын алу (9). Ақпараттың жетіспеушілігі - жүйке жасушаларының қоршаған тіндердің жасуша түрлерімен салыстырғанда метаболикалық икемділігі өте шектеулі деп кеңінен қарастырылуы (10). Бұл жасушалар синаптикалық берілісті ынталандыру және жарақат пен ауру жағдайларына жауап беру үшін нейрондарға метаболиттерді жеткізуді үйлестіруде орталық рөл атқаратынын ескере отырып, жасуша метаболизмін ми тінінің қиын жағдайларына бейімдеу мүмкіндігі глиальды жасушалармен шектеледі (11-14). Сонымен қатар, ми тінінің жасушалық гетерогенділігі белгілі бір нейрондық кіші топтарда болатын метаболикалық өзгерістерді зерттеуге айтарлықтай кедергі келтіреді. Нәтижесінде, нейрондардағы митохондриялық дисфункцияның нақты жасушалық және метаболикалық салдары туралы аз мәлімет бар.
Митохондриялық дисфункцияның метаболикалық салдарын түсіну үшін біз митохондриялық сыртқы мембрана бірігуінің (Mfn2) бұзылуынан туындаған нейродегенерацияның әртүрлі сатыларында Пуркинье нейрондарын (PN) бөліп алдық. Адамдардағы Mfn2 мутациялары Шаркот-Мари-Тіс 2A типі (15) деп аталатын тұқым қуалайтын моторлы сенсорлық нейропатияның бір түрімен байланысты болғанымен, тышқандардағы Mfn2 шартты түрде жойылуы тотығудың фосфорлану (OXPHOS) дисфункция әдісінің танымал индукциясы болып табылады. Әртүрлі нейрондық кіші типтер (16-19) және нәтижесінде пайда болған нейродегенеративті фенотип қозғалыс бұзылыстары (18, 19) немесе мишық атаксия (16) сияқты прогрессивті неврологиялық симптомдармен бірге жүреді. Белгісіз сандық (LFQ) протеомика, метаболомика, бейнелеу және вирусологиялық әдістердің тіркесімін қолдана отырып, біз прогрессивті нейродегенерацияның пируваткарбоксилазасын (PCx) және PN-нің in vivo артериосклерозына қатысатын басқа факторларды күшті түрде индукциялайтынын көрсетеміз. Ферменттердің экспрессиясы. Бұл тұжырымның өзектілігін тексеру үшін біз Mfn2 жетіспейтін PN-дердегі PCx экспрессиясын арнайы төмендеттік және бұл операция тотығу стрессін күшейтіп, нейродегенерацияны жеделдететінін анықтадық, осылайша азооспермия жасуша өліміне метаболикалық бейімделуді қамтамасыз ететінін дәлелдедік. MFN2-нің ауыр экспрессиясы ауыр OXPHOS жетіспеушілігімен, митохондриялық ДНҚ-ның көп мөлшерде тұтынылуымен және митохондриялық желінің бұзылуымен терминалды дегенерация PN-ді толығымен құтқара алады, бұл нейродегенерацияның бұл түрі жасуша өліміне дейін аурудың дамыған сатысында да қалпына келе алатынын көрсетеді.
Mfn2 нокаутқа ұшыраған PN-дердегі митохондрияларды визуализациялау үшін біз Cre-тәуелді митохондрияларға сары флуоресцентті ақуызды (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессиясын нысанаға алуға мүмкіндік беретін тышқан штаммын қолдандық және митохондриялық морфологияны in vivo тексердік. Біз PN-дердегі Mfn2 генінің жойылуы митохондриялық желінің біртіндеп бөлінуіне әкелетінін анықтадық (S1A суреті), ал ең ерте өзгеріс 3 апталық жаста анықталды. Керісінше, калбиндин иммундық бояуының жоғалуымен дәлелденгендей, PN жасуша қабатының айтарлықтай дегенерациясы 12 апталық жаста ғана басталды (1, A және B сурет). Митохондриялық морфологиядағы ең ерте өзгерістер мен нейрондық өлімнің көрінетін басталуы арасындағы уақыт сәйкессіздігі бізді жасуша өліміне дейін митохондриялық дисфункция тудыратын метаболикалық өзгерістерді зерттеуге итермеледі. Біз YFP (YFP+) экспрессиялайтын PN (1C сурет) және бақылау тышқандарында (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) бөліп алу үшін флуоресценциямен белсендірілген жасуша сұрыптау (FACS) негізіндегі стратегияны әзірледік, ол бұдан әрі CTRL деп аталады (S1B сурет). YFP сигналының салыстырмалы қарқындылығына негізделген қақпа стратегиясын оңтайландыру бізге YFP+ денесін (YFPhigh) PN еместерден (YFPneg) (S1B сурет) немесе болжамды флуоресцентті аксон/дендриттік фрагменттерден (YFPlow; S1D сурет, сол жақта) тазартуға мүмкіндік береді, бұл конфокальды микроскоппен расталады (S1D сурет, оң жақта). Жіктелген популяцияның сәйкестігін тексеру үшін біз LFQ протеомикасын, содан кейін негізгі компоненттік талдауды жүргіздік және YFPhigh және YFPneg жасушалары арасында айқын бөліну бар екенін анықтадық (S1C сурет). YFPhigh жасушалары белгілі PN маркерлерінің (яғни Calb1, Pcp2, Grid2 және Itpr3) таза байытылғанын көрсетті (21, 22), бірақ нейрондарда немесе басқа жасуша түрлерінде жиі экспрессияланатын ақуыздардың байытылғаны байқалмады (1D сурет). Тәуелсіз эксперименттерде жиналған жіктелген YFPhigh жасушаларындағы үлгілерді салыстыру корреляция коэффициентінің > 0,9 екенін көрсетті, бұл биологиялық репликалар арасында жақсы қайталанымдылықты көрсетеді (S1E сурет). Қысқаша айтқанда, бұл деректер мүмкін болатын PN-ді жедел және нақты оқшаулау жоспарымызды растады. Қолданылған L7-cre драйвер жүйесі босанғаннан кейінгі алғашқы аптада мозаикалық рекомбинацияны тудыратындықтан (23), біз CTRL және шартты (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейрондарын жинайтын тышқандарды жоюды бастадық. Рекомбинация аяқталғаннан кейін, ол 4 апталық жасында Mfn2cKO деп аталады. Соңғы нүкте ретінде біз айқын митохондриялық фрагментацияға қарамастан, PN қабаты бүтін болған 8 апталық жасты таңдадық (1B сурет және S1A сурет). Жалпы алғанда, біз барлығы 3013 ақуызды сандық түрде анықтадық, оның шамамен 22%-ы митохондриялық протеомды митохондриялық ретінде пайдалануға негізделген MitoCarta 2.0 аннотацияларына негізделген (1E сурет) (1E сурет) (24). 8-аптада жүргізілген дифференциалды ген экспрессиясын талдау барлық ақуыздардың тек 10,5%-ында айтарлықтай өзгерістер болғанын көрсетті (1F сурет және S1F сурет), оның ішінде 195 ақуыз төмендеген және 120 ақуыз жоғарылаған (1F сурет). Айта кету керек, бұл деректер жиынтығының «инновациялық жол талдауы» дифференциалды түрде экспрессияланған гендер негізінен шектеулі белгілі бір метаболикалық жолдар жиынтығына жататынын көрсетеді (1G сурет). Қызығы, OXPHOS және кальций сигнализациясымен байланысты жолдардың төмендеуі біріктіру жетіспейтін PN-дерде митохондриялық дисфункцияның индукциясын растаса да, негізінен аминқышқылдарының метаболизмін қамтитын басқа санаттар айтарлықтай жоғарылайды, бұл митохондриялық PN-дерде болатын метаболизмге сәйкес келеді. Қайта сымдау тұрақты дисфункция болып табылады.
(A) CTRL және Mfn2cKO тышқандарының мишық бөліктерінің репрезентативті конфокальды фотосуреттері PN-дердің біртіндеп жоғалуын көрсетеді (кальбиндин, сұр); ядролар DAPI-мен қарама-қарсы боялған. (B) (A) сандық анықтау (дисперсияның бір жақты талдауы, ***P<0,001; n = үш тышқаннан 4-тен 6-ға дейінгі шеңбер). (C) Тәжірибелік жұмыс процесі. (D) Пуркиньеге (жоғарғы) және басқа жасуша түрлеріне (ортасында) тән маркерлердің жылу картасының таралуы. (E) Жіктелген PN-де анықталған митохондриялық ақуыздар санын көрсететін Венн диаграммасы. (F) 8 аптадағы Mfn2cKO нейрондарындағы дифференциалды түрде экспрессияланған ақуыздардың жанартау графигі (маңыздылық шегініс мәні 1,3). (G) Шығармашылық жолын талдау 8 апта ретінде жіктелген Mfn2cKO PN-дегі ең маңызды бес жоғары-реттеу (қызыл) және төмен-реттеу (көк) жолдарды көрсетеді. Әрбір анықталған ақуыздың орташа экспрессия деңгейі көрсетілген. Сұр реңкті жылу картасы: түзетілген P мәні. нс, маңызды емес.
Протеомика деректері I, III және IV кешендердің ақуыз экспрессиясының біртіндеп төмендегенін көрсетті. I, III және IV кешендердің барлығында маңызды мтДНҚ-мен кодталған суббірліктер болды, ал тек ядролық кодталған II кешен іс жүзінде әсер етпеді (2A сурет және S2A сурет). . Протеомика нәтижелеріне сәйкес, мишық тінінің бөлімдерінің иммуногистохимиясы PN-дегі IV кешеннің MTCO1 (митохондриялық цитохром С оксидаза суббірлігі 1) суббірлігінің деңгейі біртіндеп төмендегенін көрсетті (2B сурет). мтДНҚ-мен кодталған Mtatp8 суббірлігі айтарлықтай төмендеді (S2A сурет), ал ядролық кодталған АТФ синтаза суббірлігінің тұрақты күй деңгейі өзгеріссіз қалды, бұл мтДНҚ экспрессиясы тұрақты болған кезде белгілі тұрақты АТФ синтаза субжинағы F1 кешеніне сәйкес келеді. Түзілу тұрақты. Үзіліс (7). Сұрыпталған Mfn2cKO PN-деріндегі мтДНҚ деңгейін нақты уақыт режиміндегі полимеразды тізбекті реакция (qPCR) арқылы бағалау мтДНҚ көшірме санының біртіндеп төмендегенін растады. Бақылау тобымен салыстырғанда, 8 апталық жаста мтДНҚ деңгейінің тек 20%-ы ғана сақталды (2C сурет). Осы нәтижелерге сәйкес, ДНҚ-ны анықтау үшін Mfn2cKO PN-дерін конфокальды микроскопиямен бояу қолданылды, бұл митохондриялық нуклеотидтердің уақытқа тәуелді тұтынуын көрсетті (2D сурет). Біз митохондриялық ақуыздың ыдырауына және стресстік реакцияға қатысатын кейбір кандидаттардың ғана жоғарылағанын анықтадық, соның ішінде Lonp1, Afg3l2 және Clpx, және OXPHOS кешенінің жиналу факторлары. Апоптозға қатысатын ақуыздар деңгейінде айтарлықтай өзгерістер анықталмады (S2B сурет). Сол сияқты, кальций тасымалына қатысатын митохондриялар мен эндоплазмалық тор арналарында тек шамалы өзгерістер бар екенін анықтадық (S2C сурет). Сонымен қатар, аутофагияға байланысты ақуыздарды бағалау кезінде айтарлықтай өзгерістер анықталмады, бұл иммуногистохимия және электронды микроскопия арқылы in vivo байқалған аутофагосомалардың көрінетін индукциясына сәйкес келеді (S3 сурет). Дегенмен, PN-дегі прогрессивті OXPHOS дисфункциясы айқын ультрақұрылымдық митохондриялық өзгерістермен қатар жүреді. Митохондриялық кластерлерді 5 және 8 апталық Mfn2cKO PN жасуша денелері мен дендриттік ағаштарында көруге болады, ал ішкі мембрана құрылымы терең өзгерістерге ұшырады (S4, A және B суреттер). Осы ультрақұрылымдық өзгерістерге және мтДНҚ-ның айтарлықтай төмендеуіне сәйкес, тетраметилродамин метил эфирімен (TMRM) жедел ми мишық кесінділерін талдау Mfn2cKO PN-деріндегі митохондриялық мембрана потенциалының айтарлықтай төмендегенін көрсетті (S4C сурет).
(A) OXPHOS кешенінің экспрессия деңгейінің уақыттық талдауы. Тек 8 аптада P<0,05 болатын ақуыздарды қарастырыңыз (екі жақты ANOVA). Нүктелі сызық: CTRL-мен салыстырғанда түзету жоқ. (B) Сол жақта: MTCO1 антиденелерімен белгіленген мишық кесіндісінің мысалы (масштабты жолақ, 20 мкм). Пуркинье жасуша денелері алып жатқан аумақ сары түспен жабылған. Оң жақта: MTCO1 деңгейлерін сандық анықтау (дисперсияның бір жақты талдауы; үш тышқаннан алынған n = 7-ден 20-ға дейінгі жасушалар талданады). (C) сұрыпталған PN-дегі мтДНҚ көшірмесінің санын qPCR талдауы (дисперсияның бір жақты талдауы; n = 3-тен 7-ге дейінгі тышқандар). (D) Сол жақта: ДНҚ антиденелерімен белгіленген мишық кесіндісінің мысалы (масштабты жолақ, 20 мкм). Пуркинье жасуша денелері алып жатқан аумақ сары түспен жабылған. Оң жақта: мтДНҚ зақымдануларын сандық бағалау (дисперсияның бір жақты талдауы; үш тышқаннан 5-тен 9-ға дейінгі жасушалар). (E) Тұтас жасушалық патч қысқыш жазбасында митоYFP + Пуркинье жасушаларын көрсететін жедел мишық кесіндісінің мысалы (көрсеткі). (F) IV қисығын сандық бағалау. (G) CTRL және Mfn2cKO Пуркинье жасушаларындағы деполяризациялық ток инъекциясының репрезентативті жазбалары. Жоғарғы із: AP-ны іске қосқан алғашқы импульс. Төменгі із: AP-ның максималды жиілігі. (H) Постсинаптикалық өздігінен кірулердің (sPSP) сандық бағалауы. Репрезентативті жазба ізі және оның масштабтау коэффициенті (I) көрсетілген. Үш тышқаннан n = 5-тен 20-ға дейінгі жасушаларда талданған дисперсияның бір жақты талдауы. Деректер орташа ±SEM ретінде көрсетілген; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Перфорацияланған патч қысқыш режимін пайдаланып жазылған өздігінен AP-ның репрезентативті іздері. Жоғарғы із: AP-ның максималды жиілігі. Төменгі із: бір AP-ның масштабтауы. (K) (J) бойынша орташа және максималды AP жиілігін сандық түрде анықтаңыз. Манн-Уитни сынағы; төрт тышқаннан алынған n = 5 жасуша талданды. Деректер орташа ± SEM ретінде көрсетілген; маңызды емес.
8 апталық Mfn2cKO PN-де айқын OXPHOS зақымдануы анықталды, бұл нейрондардың физиологиялық функциясының айтарлықтай ауытқуын көрсетеді. Сондықтан, біз OXPHOS жетіспейтін нейрондардың пассивті электрлік сипаттамаларын 4-5 аптада және 7-8 аптада жедел мишық кесінділерінде тұтас жасушалық патч қысқышын жазу арқылы талдадық (2E сурет). Күтпеген жерден, Mfn2cKO нейрондарының орташа тыныштық мембраналық потенциалы мен кіріс кедергісі бақылау тобына ұқсас болды, дегенмен жасушалар арасында нәзік айырмашылықтар болды (1-кесте). Сол сияқты, 4-5 апталық жаста ток-кернеу қатынасында (IV қисығы) айтарлықтай өзгерістер байқалмады (2F сурет). Дегенмен, 7-8 апталық Mfn2cKO нейрондары IV режимінен (гиперполяризация сатысы) аман қалмады, бұл осы кеш кезеңде гиперполяризация потенциалына айқын сезімталдық бар екенін көрсетеді. Керісінше, Mfn2cKO нейрондарында қайталанатын әрекет потенциалының (ӘП) разрядтарын тудыратын деполяризациялық токтар жақсы төзімді, бұл олардың жалпы разряд үлгілерінің 8 апталық бақылау нейрондарынан айтарлықтай ерекшеленбейтінін көрсетеді (1-кесте және 2G-сурет). Сол сияқты, өздігінен пайда болатын постсинаптикалық токтардың (СПС) жиілігі мен амплитудасы бақылау тобының жиілігімен салыстырмалы болды, ал оқиғалардың жиілігі 4 аптадан 5 аптаға дейін, 7 аптадан 8 аптаға дейін өсті, ұқсас өсіммен (2-сурет, H және I). ПН-дегі синаптикалық жетілу кезеңі (25). Ұқсас нәтижелер перфорацияланған ПН патчтарынан кейін алынды. Бұл конфигурация жасушалық АТФ ақауларының мүмкін компенсациясын болдырмайды, бұл тұтас жасуша патч қысқышын жазуда болуы мүмкін. Атап айтқанда, Mfn2cKO нейрондарының тыныштық мембранасының потенциалы мен өздігінен ату жиілігіне әсер етілмеді (2-сурет, J және K). Қорытындылай келе, бұл нәтижелер айқын OXPHOS дисфункциясы бар PN-дердің жоғары жиілікті разряд үлгілерімен жақсы күресе алатынын көрсетеді, бұл олардың қалыпты электрофизиологиялық реакцияларды сақтауға мүмкіндік беретін компенсация механизмінің бар екенін көрсетеді.
Деректер орташа ± SEM (дисперсияның бір жақты талдауы, Холм-Сидактың көптік салыстыру сынағы; *P<0.05) ретінде көрсетіледі. Бірлік нөмірі жақшалармен көрсетілген.
Біз протеомика деректер жинағындағы кез келген санатта (1G сурет) OXPHOS-тың ауыр жетіспеушілігіне қарсы тұра алатын жолдар бар-жоғын зерттеуді мақсат еттік, осылайша зақымдалған PN-нің неліктен қалыпты электрофизиологияны сақтай алатынын түсіндірдік (2-сурет, E-ден K-ге дейін). . Протеомика талдауы тармақталған тізбекті аминқышқылдарының (BCAA) катаболизміне қатысатын ферменттердің айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті (3A сурет және S5A сурет), ал соңғы өнім ацетил-КоА (CoA) немесе сукцинил КоА артериосклероз қышқылы (TCA) цикліндегі трикарбоксилаттарды толықтыра алады. Біз BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) және BCAT2 құрамының жоғарылағанын анықтадық. Олар α-кетоглютараттан глутамат түзу арқылы BCAA катаболизмінің бірінші кезеңін катализдейді (26). Тармақталған тізбекті кетоқышқылдық дегидрогеназа (BCKD) кешенін құрайтын барлық суббірліктер жоғары реттеледі (кешен пайда болған BCAA көміртегі қаңқасының кейінгі және қайтымсыз декарбоксилденуін катализдейді) (3A және S5A суреттері). Дегенмен, сұрыпталған PN-де BCAA-ның өзінде ешқандай айқын өзгерістер байқалмады, бұл осы маңызды аминқышқылдарының жасушалық сіңуінің артуына немесе TCA циклін толықтыру үшін басқа көздерді (глюкоза немесе сүт қышқылы) пайдалануға байланысты болуы мүмкін (S5B суреті). OXPHOS жетіспейтін PN-дерде 8 апталық жаста глутаминнің ыдырауы мен трансаминация белсенділігінің артуы байқалды, бұл митохондриялық ферменттер глутаминаза (GLS) және глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) жоғары реттелуімен көрінуі мүмкін (3, A және C суреті). Айта кету керек, GLS жоғарылауы глутаминаза С изоформасымен (GLS-GAC) шектеледі (Mfn2cKO/CTRL өзгерісі шамамен 4,5 есе, P = 0,05) және оның қатерлі ісік тіндеріндегі ерекше жоғарылауы митохондриялық биоэнергияны қолдай алады (27).
(A) Жылулық картасында 8 аптадағы көрсетілген жол үшін ақуыз деңгейінің өзгеруі көрсетілген. (B) PCx антиденелерімен белгіленген мишық кесіндісінің мысалы (масштабты жолақ, 20 мкм). Сары көрсеткі Пуркинье жасуша денесіне нұсқайды. (C) Атеросклероздың маңызды кандидаты ретінде анықталған уақыт курсы ақуыз экспрессиясын талдау (бірнеше t-тесті, *FDR <5%; n = 3-5 тышқан). (D) Жоғарыда: [1-13C]пируват индикаторында қамтылған белгіленген көміртекті енгізудің әртүрлі жолдарын көрсететін схемалық диаграмма (яғни, PDH немесе транс-артериялық жол арқылы). Төменгі жағында: Скрипка диаграммасында жедел мишық кесінділері [1-13C]пируватпен белгіленгеннен кейін аспарагин қышқылына, лимон қышқылына және алма қышқылына айналған бір таңбаланған көміртектің (M1) пайызы көрсетілген (жұпталған t-тесті; ** P <0.01). (E) Көрсетілген жолдың кешенді уақыт тарихын талдау. 8 аптада тек P<0,05 болатын ақуыздарды ғана қарастырыңыз. Үзік сызық: түзету мәні жоқ (дисперсияның екі жақты талдауы; * P <0,05; *** P <0,001). Деректер орташа ± SEM ретінде көрсетілген.
Біздің талдауымызда BCAA катаболизмі негізгі жоғары реттеу жолдарының біріне айналды. Бұл факт TCA цикліне енетін желдету көлемі OXPHOS жетіспейтін PN кезінде өзгеруі мүмкін екенін көрсетеді. Бұл нейрондық метаболикалық қайта байланыстың негізгі түрін білдіруі мүмкін, бұл OXPHOS ауыр дисфункциясын сақтау кезінде нейрондық физиологияға және өмір сүруге тікелей әсер етуі мүмкін. Осы гипотезаға сәйкес, біз негізгі антиатеросклеротикалық фермент PCx жоғары реттелетінін анықтадық (Mfn2cKO/CTRL шамамен 1,5 есе өзгереді; 3A сурет), бұл пируваттың оксалоацетатқа айналуын катализдейді (28), ол ми тінінде болады деп есептеледі. экспрессиясы астроциттермен шектелген (29, 30). Протеомика нәтижелеріне сәйкес, конфокальды микроскопия PCx экспрессиясы OXPHOS жетіспейтін PN-дерде ерекше және айтарлықтай жоғарылағанын, ал PCx реактивтілігі негізінен бақылаудың көршілес Бергман глиальды жасушаларымен шектелгенін көрсетті (3B сурет). PCx-тің байқалған жоғарылауын функционалды түрде тексеру үшін біз мишықтың жедел кесінділерін [1-13C]пируват индикаторымен өңдедік. Пируват пируватдегидрогеназа (PDH) арқылы тотыққан кезде, оның изотоптық белгісі жоғалып кетті, бірақ пируват тамырлық реакциялар арқылы метаболизденген кезде TCA циклінің аралық өнімдеріне қосылады (3D сурет). Протеомика деректерімізді қолдау үшін біз Mfn2cKO кесінділерінің аспарагин қышқылында осы индикатордан көптеген маркерлерді байқадық, ал лимон қышқылы мен алма қышқылы да орташа үрдіске ие болды, бірақ маңызды емес (3D сурет).
МитоПарк тышқандарының дофаминдік нейрондарының митохондриялық транскрипция факторы А генін (Tfam) арнайы бұзуынан туындаған митохондриялық дисфункциясы бар дофаминдік нейрондарында (S6B сурет) PCx экспрессиясы да айтарлықтай жоғарылаған (31), бұл ацетон қышқылының артериосклерозын көрсетеді. Аурудың пайда болуы организмдегі нейрондық OXPHOS дисфункциясы кезінде реттеледі. Артериосклерозбен байланысты болуы мүмкін нейрондарда экспрессиялануы мүмкін бірегей ферменттердің (32-34) OXPHOS жетіспейтін PN-дерде, мысалы, пропионил-КоА карбоксилазасында (PCC-A), малонил-КоА пропионил-КоА-ны сукцинил-КоА-ға айналдыратын және митохондриялық алма ферменті 3 (ME3), оның негізгі рөлі пируватты малаттан қалпына келтіру болып табылады (3-сурет, A және C) (33, 35). Сонымен қатар, біз Pdk3 ферментінің айтарлықтай артуын анықтадық, ол PDH фосфорланады және осылайша белсенділігін жояды (36), ал PDH-ны белсендіретін Pdp1 ферментінде немесе PDH фермент кешенінің өзінде ешқандай өзгерістер анықталмады (3A сурет). Mern2cKO PN-дерінде Ser293-тегі PDH кешенінің пируватдегидрогеназа E1 компонентінің α1 суббірлігі α (PDHE1α) суббірлігінің фосфорлануы (PDH ферменттік белсенділігін тежейтіні белгілі) үнемі күшейген (S6C сурет) (S6C сурет). Пируваттың тамырларға қол жеткізу мүмкіндігі жоқ.
Соңында, біз серин мен глицин биосинтезінің супержолы, байланысты митохондриялық фолат (1C) циклі және пролин биосинтезі (1G және S5C суреттері), есептерге сәйкес, белсендіру процесінде айтарлықтай жоғарылайтынын анықтадық. Айналадағы тіндер митохондриялық дисфункциямен белсендіріледі (5-7). Осы протеомика деректерін қолдайтын конфокальды талдау OXPHOS жоқ PN-де 8 апталық тышқандардың мишық кесектеріне митохондриялық фолат циклінің негізгі ферменті болып табылатын серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2) әсер еткенін көрсетті. Айтарлықтай иммундық жауап (S5D суреті). 13 CU-глюкозамен инкубацияланған жедел мишық кесектерінде метаболикалық бақылау эксперименттері серин мен пролин биосинтезінің жоғарылауын растады, бұл көміртек изоформаларының серин мен пролинге ағынының артқанын көрсетеді (S5E суреті). GLS және GPT2 арқылы қозғалатын реакциялар глутаминнен глутаматтың синтезіне және глутамат пен α-кетоглутарат арасындағы трансаминацияға жауапты болғандықтан, олардың жоғарылауы OXPHOS жетіспейтін нейрондарда глутаматқа деген сұраныстың артқанын көрсетеді. Бұл пролиннің биосинтезінің артуын сақтауға бағытталған болуы мүмкін (S5C сурет). Бұл өзгерістерден айырмашылығы, PN-спецификалық Mfn2cKO тышқандарынан алынған мишық астроциттерінің протеомикалық талдауы бұл жолдардың (барлық антипероксидазаларды қоса алғанда) экспрессиясында айтарлықтай өзгермегенін көрсетті, осылайша бұл метаболикалық қайта бағыттаудың ыдыраған PN-ге селективті екенін көрсетеді (S6 сурет, D-ден G-ге дейін).
Қорытындылай келе, бұл талдаулар ПН-дегі нақты метаболикалық жолдардың уақытша белсенділігінің айтарлықтай әртүрлі үлгілерін анықтады. Нейрондық митохондриялық функцияның қалыптан тыс болуы ерте атеросклерозға және 1C ремоделизациясына (3E сурет және S5C сурет), тіпті I және IV кешендерінің экспрессиясындағы болжамды өзгерістерге әкелуі мүмкін болса да, серин де ново синтезіндегі өзгерістер тек кеш сатыларда ғана айқын болды. OXPHOS дисфункциясы (3E сурет және S5C сурет). Бұл зерттеулер стресс тудыратын митохондриялық (1C циклі) және цитоплазмалық (серин биосинтезі) реакциясы TCA цикліндегі атеросклероздың жоғарылауымен синергетикалық түрде нейрондық метаболизмді қайта құру үшін әрекет ететін тізбекті процесті анықтайды.
8 апталық OXPHOS жетіспейтін PN-дер жоғары жиілікті қоздыру белсенділігін сақтай алады және митохондриялық дисфункцияны өтеу үшін айтарлықтай метаболикалық қайта қосылуға ұшырайды. Бұл жаңалық тіпті осы сәтте де бұл жасушалар нейродегенерацияны кешіктіру немесе алдын алу үшін терапиялық араласу алуы мүмкін деген қызықты мүмкіндікті тудырады. Кеш. Біз бұл мүмкіндікті екі тәуелсіз араласу арқылы шештік. Бірінші әдісте біз Cre-тәуелді адено-ассоциацияланған вирус (AAV) векторын жасадық, осылайша MFN2 in vivo OXPHOS жетіспейтін PN-дерде селективті түрде экспрессиялануы мүмкін (S7A сурет). MFN2 кодтайтын AAV және флуоресцентті репортер гені mCherry (Mfn2-AAV) in vitro бастапқы нейрондық дақылдарда тексерілді, бұл MFN2-нің Cre-тәуелді түрде экспрессиялануына әкелді және митохондриялық морфологияны сақтап қалды, осылайша Mfn2cKO нейрондарында нейромутацияның алдын алды (S7, B, D және E суреттері). Әрі қарай, біз 8 апталық Mfn2-AAV-ны Mfn2cKO және бақылау тышқандарының мишық қыртысына стереотаксикалық түрде жеткізу үшін in vivo тәжірибелер жүргіздік және 12 апталық тышқандарды талдадық (4A сурет). Емделген Mfn2cKO тышқандары өлді (1-сурет, A және B) (16). In vivo вирустық трансдукция кейбір мишық шеңберлерінде PN селективті экспрессиясына әкелді (S7, G және H суреттер). Тек mCherry экспрессиялайтын бақылау AAV (Ctrl-AAV) инъекциясы Mfn2cKO жануарларында нейродегенерация дәрежесіне айтарлықтай әсер еткен жоқ. Керісінше, Mfn2-AAV арқылы трансдукцияланған Mfn2cKO талдауы PN жасуша қабатының айтарлықтай қорғаныс әсерін көрсетті (4-сурет, B және C). Атап айтқанда, нейрон тығыздығы бақылау жануарларынан іс жүзінде ажыратылмайтын сияқты (4-сурет, B және C суреттері және S7, H және I суреттері). MFN1 экспрессиясы, бірақ MFN2 емес, нейрондық өлімді сақтауда бірдей тиімді (4C сурет және S7, C және F суреттері), бұл эктопиялық MFN1 экспрессиясы MFN2 жетіспеушілігін тиімді түрде толықтыра алатынын көрсетеді. Бірыңғай PN деңгейіндегі одан әрі талдау Mfn2-AAV митохондрияның ультрақұрылымын айтарлықтай қалпына келтіргенін, мтДНҚ деңгейлерін қалыпқа келтіргенін және ангиогенезге қарсы маркер PCx-тің жоғары экспрессиясын қалпына келтіргенін көрсетті (4-сурет, C-ден E-ге дейін). Құтқарылған Mfn2cKO тышқандарын тыныштық күйінде визуалды тексеру олардың қалып-күйі мен қозғалыс симптомдарының (S1-ден S3-ке дейінгі қозғалыс) жақсарғанын көрсетті. Қорытындылай келе, бұл эксперименттер OXPHOS-та қатты жетіспейтін PN-ге MFN2-ні кешіктіріп қайта енгізу мтДНҚ тұтынуын қалпына келтіру және атеросклерозды тудыру үшін жеткілікті екенін, осылайша аксон дегенерациясы мен нейрондық өлімнің in vivo алдын алатынын көрсетеді.
(A) Көрсетілген метаболикалық жол белсендірілген кезде MFN2 кодтайтын AAV инъекциясының тәжірибелік кестесін көрсететін схема. (B) Mfn2cKO тышқандарында 8 аптада трансдукцияланған және анти-Кальбиндин антиденесімен белгіленген 12 апталық мишық кесінділерінің типтік конфокальды кескіндері. Оң жақта: Аксон талшықтарының масштабталуы. Аксон зумының масштабы 450 және 75 мкм. (C) Сол жақта: AAV трансдукция ілмегіндегі (AAV+) Пуркинье жасушаларының тығыздығын сандық анықтау (дисперсияның бір жақты талдауы; n = 3 тышқан). Оң жақта: 12-аптада трансдукцияланған PN-дегі мтДНҚ фокустық талдауы (жұпталмаған t-тесті; үш тышқаннан алынған n = 6 жасуша). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Көрсетілген вирустық векторлармен трансдукцияланған Mfn2cKO мишық кесінділерінің PN-дерінің типтік трансмиссиялық электронды микрографиялары. Қызғылт маска дендриттер алып жатқан аумақты, ал сары нүктелі шаршы оң жақта берілген масштабты көрсетеді; n ядроны білдіреді. Масштаб жолағы, 1 мкм. (E) 12 аптада PN-де трансдукцияланған PCx бояуының мысалын көрсетеді. Масштаб жолағы, 20 мкм. OE, шамадан тыс экспрессия; FC, қатпардың өзгеруі.
Соңында, біз OXPHOS дисфункциясын бастан кешірген PN-дерде пероксидаза тудыратын жасушалардың тіршілік етуінің маңыздылығын зерттедік. Біз тышқанның PCx мРНҚ-сын (AAV-shPCx) арнайы нысанаға алатын AAV-shRNA (қысқа шашты РНҚ) кодтайтын mCherry генерацияладық және вирусты немесе оның араласқан бақылауын (AAV-scr) Mfn2cKO тышқандарының мишыққа енгіздік. Инъекция төртінші аптада жасалды (5A сурет), PCx экспрессиясы артқан кезеңде (3C сурет) және PN жасуша қабаты әлі бүтін болған кезде PCx-ті тиімді нокдаунға қол жеткізу үшін (1A сурет). Айта кету керек, PCx-ті нокдаун (S8A сурет) PN өлімінің айтарлықтай жеделдеуіне әкеледі, бұл жұқтырған сақинамен шектеледі (5, B және C суреттер). PCx жоғары реттелуінен туындаған метаболикалық әсерлердің механизмін түсіну үшін біз глутатионды бағалау үшін PCx нокдаунынан және AAV арқылы жүзеге асырылатын оптикалық биосенсор Grx1-roGFP2 бір мезгілде экспрессияланғаннан кейінгі PN-дердің тотығу-тотықсыздану күйін зерттедік (S8, B-D суреті). Пептидтік тотығу-тотықсыздану потенциалының салыстырмалы өзгерісі (38). Содан кейін, FLIM жағдайларын тексергеннен кейін цитоплазмалық тотығу-тотықсыздану күйіндегі ықтимал өзгерістерді анықтау үшін 7 апталық Mfn2cKO немесе бақылау қоқыс жолдастарының жедел ми кесінділерінде екі фотонды флуоресценциялық өмір бойы бейнелеу микроскопиясын (FLIM) жүргіздік (S8, E-G суреті). Талдау PCx экспрессиясы жоқ бір Mfn2cKO PN-дерінің тотығу күйінің айтарлықтай жоғарылағанын көрсетті, бұл тек араласқан shRNA экспрессиялайтын бақылау нейрондарынан немесе Mfn2cKO PN-дерінен ерекшеленеді (5, D және E суреті). PCx экспрессиясы төмендеген кезде, жоғары тотығу күйін көрсететін Mfn2cKO PN пайызы үш еседен астамға артты (5E сурет), бұл PCx-тің жоғары реттелуі дегенерацияланған нейрондардың тотығу-тотықсыздану қабілетін сақтап қалғанын көрсетеді.
(A) Көрсетілген метаболикалық жол белсендірілген кезде shPCx кодтайтын AAV инъекциясының тәжірибелік кестесін көрсететін схема. (B) 4 аптада кальциневринге қарсы антиденемен трансдукцияланған және белгіленген Mfn2cKO тышқандарындағы 8 апталық мишық кесінділерінің типтік конфокальды фотосуреттері. Масштаб жолағы, 450 мкм. (C) AAV трансдукцияланған ілмектердегі Пуркинье жасушаларының тығыздығын сандық бағалау (дисперсияның бір жақты талдауы; n = 3-тен 4-ке дейін тышқан). Деректер орташа ± SEM ретінде көрсетілген; ***P<0.001. (D) FLIM типтік суреті көрсетілген тәжірибелік жағдайларда глутатион тотығу-тотықсыздану сенсоры Grx1-roGFP2 экспрессиялайтын 7 апталық PN-нің орташа өмір сүру ұзақтығын көрсетеді. LUT (іздеу кестесі) қатынасы: өмір сүру уақыт аралығы (пикосекундтарда). Масштаб жолағы, 25 мкм. (E) Гистограмма (D)-ден (әр шартта екі тышқандағы n=158-ден 368 жасушаға дейін) Grx1-roGFP2 өмір сүру мәндерінің таралуын көрсетеді. Әрбір гистограмманың үстіндегі дөңгелек диаграмма: CTRL-AAV-scr орташа өмір сүру мәнінің 1 SD-ден асатын, айтарлықтай ұзын (қызыл, тотыққан) немесе қысқа (көк, қысқартылған) өмір сүру мәндері бар жасушалар санын көрсетеді. (F) Ұсынылған модель нейрондық PCx жоғарылауының қорғаныс әсерін көрсетеді.
Жалпы алғанда, біз ұсынған деректер MFN2 қайта экспрессиясы ауыр OXPHOS жетіспеушілігімен, ауыр мтДНҚ сарқылуымен және өте қалыптан тыс истаға ұқсас морфологиямен ауыратын дамыған ПН-ны толығымен құтқара алатынын, осылайша тіпті дамыған ауруларда да үздіксіз прогресті қамтамасыз ете алатынын көрсетеді. Нейродегенерация жасуша өліміне дейінгі кезеңнің қайтымды дәлелдерін ұсынады. Метаболикалық икемділіктің бұл дәрежесі нейрондардың атеросклерозды (TCA циклінің қайта қосылуы) тудыру қабілетімен одан әрі айқындалады, бұл OXPHOS жетіспейтін ПН-дерде PCx экспрессиясын тежейді және жасуша өлімін күшейтеді, осылайша қорғаныс рөлін атқарады (5F сурет).
Бұл зерттеуде біз PN-нің OXPHOS дисфункциясына реакциясы метаболикалық бағдарламалармен белсендірілген дифференциалды белсендіру жолы арқылы біртіндеп TCA циклінің атеросклерозына конверсияланатыны туралы дәлелдер келтірдік. Біз протеомикалық талдауды көптеген қосымша әдістермен растадық және ауыр митохондриялық дисфункцияға тап болған кезде нейрондарда бұрын белгісіз метаболикалық серпімділік түрі бар екенін анықтадық. Біздің таңқаларлығы, бүкіл қайта жаңғыру процесі нейродегенерациямен бірге жүретін терминалды метаболикалық күйді міндетті түрде белгілемейді, бірақ біздің деректеріміз оның жасуша өліміне дейінгі кезеңде де қолдаушы нейрон болуы мүмкін екенін көрсетеді. Функционалды компенсация механизмі. Бұл жаңалық нейрондардың организмде метаболикалық пластикалықтың айтарлықтай дәрежесіне ие екенін көрсетеді. Бұл факт MFN2-нің кейінірек қайта енгізілуі негізгі метаболикалық маркерлердің экспрессиясын кері қайтара алатынын және PN дегенерациясының алдын алатынын дәлелдейді. Керісінше, ол атеросклерозды тежейді және жүйкелерді жеделдетеді. транссексуал.
Біздің зерттеуіміздегі ең қызықты жаңалықтардың бірі - OXPHOS жетіспейтін PN-дер артериосклерозды арнайы ынталандыратын ферменттерді жоғарылату арқылы TCA циклінің метаболизмін өзгерте алады. Метаболикалық қайта құру қатерлі ісік жасушаларының кең таралған ерекшелігі болып табылады, олардың кейбіреулері тыныс алу тізбегін басқаратын және липидтер мен нуклеотидтер биосинтезінің прекурсорларының өндірісін қолдайтын қалпына келтіретін эквиваленттерді өндіру үшін TCA циклінің аралық өнімдерін толықтыру үшін глутаминге сүйенеді (39, 40). Жақында жүргізілген зерттеу OXPHOS дисфункциясын бастан кешіретін перифериялық тіндерде глутамин/глутамат метаболизмінің қайта қосылуы да маңызды ерекшелік екенін көрсетті (5, 41), мұнда глутаминнің TCA цикліне ену бағыты OXPHOS зақымдануының ауырлығына байланысты (41). Дегенмен, организмдегі нейрондық метаболикалық пластиканың кез келген ұқсастығы және оның ауру контексіндегі ықтимал маңыздылығы туралы нақты дәлелдер жоқ. Жақында жүргізілген in vitro зерттеуде бастапқы кортикальды нейрондардың нейротрансмиссия үшін глутамат пулдарын жұмылдыратыны, осылайша метаболикалық стресс жағдайында тотығу метаболизмі мен атеросклерозды ынталандыратыны көрсетілді (42). Айта кету керек, TCA циклінің ферменті сукцинатдегидрогеназаның фармакологиялық тежелуі кезінде пируват карбоксилденуі өсірілген мишық түйіршікті нейрондарында оксалоацетат синтезін сақтайды деп есептеледі (34). Дегенмен, бұл механизмдердің ми тініне физиологиялық маңызы (атеросклероз негізінен астроциттермен шектеледі деп есептеледі) әлі де маңызды физиологиялық маңызға ие (43). Бұл жағдайда біздің деректеріміз OXPHOS зақымдаған PN-дердің TCA пулының аралық өнімдерін толықтырудың екі негізгі көзі болып табылатын BCAA ыдырауына және пируват карбоксилденуіне ауысуы мүмкін екенін көрсетеді. BCAA катаболизмінің нейрондық энергия алмасуына қосқан үлесі, глутамат пен GABA-ның нейротрансмиссиядағы рөлінен басқа (44), әлі күнге дейін in vivo бұл механизмдерге ешқандай дәлел жоқ. Сондықтан, дисфункционалды PN-дер атеросклерозды күшейту арқылы ассимиляция процесімен басқарылатын TCA аралық өнімдерін тұтынуды автоматты түрде өтей алады деп болжау оңай. Атап айтқанда, аспарагин қышқылына деген сұраныстың артуын сақтау үшін PCx жоғарылауы қажет болуы мүмкін, бұл митохондриялық дисфункциясы бар пролиферацияланатын жасушаларда ұсынылады (45). Дегенмен, біздің метаболомикалық талдауымыз Mfn2cKO PN-деріндегі аспарагин қышқылының тұрақты күй деңгейінде ешқандай айтарлықтай өзгерістерді анықтаған жоқ (S6A сурет), бұл пролиферацияланатын жасушалар мен митоздан кейінгі нейрондар арасындағы аспарагин қышқылының метаболикалық пайдаланылуының әртүрлілігін көрсетеді. In vivo дисфункционалды нейрондардағы PCx жоғарылауының нақты механизмі әлі де сипатталмағанымен, біз бұл ерте реакцияның нейрондардың тотығу-тотықсыздану күйін сақтауда маңызды рөл атқаратынын көрсеттік, бұл мишық кесектеріндегі FLIM эксперименттерінде көрсетілген. Атап айтқанда, PN-дердің PCx жоғарылауын болдырмау тотығу күйіне әкелуі және жасуша өлімін жеделдетуі мүмкін. BCAA ыдырауының белсендірілуі және пируваттың карбоксилденуі митохондриялық дисфункцияның шеткергі тіндерін сипаттау жолдары емес (7). Сондықтан, олар OXPHOS жетіспейтін нейрондардың басымдықты ерекшелігі болып көрінеді, тіпті жалғыз ерекшелігі болмаса да, бұл нейродегенерация үшін маңызды.
Мишық ауруы - әдетте атаксия ретінде көрінетін және көбінесе ПН-ді зақымдайтын гетерогенді нейродегенеративті аурудың түрі (46). Бұл нейрон популяциясы митохондриялық дисфункцияға әсіресе осал, себебі тышқандардағы селективті дегенерация адамның жұлын-церебеллярлық атаксиясын сипаттайтын көптеген қозғалыс белгілерін көбейтуге жеткілікті (16, 47, 48). Есептерге сәйкес, мутант гені бар трансгендік тышқан моделі адамның жұлын-церебеллярлық атаксиясымен байланысты және митохондриялық дисфункцияға ие (49, 50), бұл PNPH-дағы OXPHOS жетіспеушілігінің салдарын зерттеудің маңыздылығын атап көрсетеді. Сондықтан, бұл бірегей нейрон популяциясын тиімді түрде оқшаулау және зерттеу әсіресе қолайлы. Дегенмен, ПН қысымға өте сезімтал және бүкіл мишық жасушалары популяциясының аз үлесін құрайтынын ескере отырып, көптеген омикаға негізделген зерттеулер үшін оларды тұтас жасушалар ретінде селективті бөлу әлі де қиын аспект болып табылады. Басқа жасуша түрлерінің (әсіресе ересек тіндердің) ластануының абсолютті болмауына қол жеткізу мүмкін емес болса да, біз протеомиканың төменгі ағысындағы талдау үшін жеткілікті мөлшерде өміршең нейрондарды алу үшін тиімді диссоциациялану қадамын FACS-пен біріктірдік және бүкіл мишықтың қолданыстағы деректер жиынтығымен салыстырғанда ақуызбен қамтудың айтарлықтай жоғары деңгейіне (шамамен 3000 ақуыз) ие болдық (51). Тұтас жасушалардың тіршілік ету қабілетін сақтау арқылы біз ұсынатын әдіс митохондриядағы метаболикалық жолдардағы өзгерістерді тексеруге ғана емес, сонымен қатар оның цитоплазмалық аналогтарындағы өзгерістерді тексеруге мүмкіндік береді, бұл жасуша түрін байыту үшін митохондриялық мембраналық белгілерді қолдануды толықтырады. Күрделі тіндердегі митохондриялар санының жаңа әдісі (52, 53). Біз сипаттайтын әдіс тек Пуркинье жасушаларын зерттеумен ғана емес, сонымен қатар митохондриялық дисфункцияның басқа модельдерін қоса алғанда, ауру мидағы метаболикалық өзгерістерді шешу үшін кез келген жасуша түріне оңай қолданылуы мүмкін.
Соңында, біз жасушалық стресстің негізгі белгілерін толығымен қалпына келтіріп, нейрондық дегенерацияның алдын алатын осы метаболикалық қайта құру процесі кезіндегі терапиялық терезені анықтадық. Сондықтан, мұнда сипатталған қайта байланыстырудың функционалдық салдарын түсіну митохондриялық дисфункция кезінде нейрондық өміршеңдікті сақтаудың мүмкін болатын емдеу әдістері туралы негізгі түсінік бере алады. Бұл принциптің басқа неврологиялық ауруларға қолданылуын толық ашу үшін мидың басқа жасуша түрлеріндегі энергия алмасуындағы өзгерістерді зерттеуге бағытталған болашақ зерттеулер қажет.
MitoPark тышқандары бұрын сипатталған (31). loxP қапталындағы Mfn2 гендері бар C57BL/6N тышқандары бұрын сипатталған (18) және L7-Cre тышқандарымен будандастырылған (23). Алынған қос гетерозиготалы ұрпақтар Mfn2 үшін Пуркиньеге тән ген нокауттарын (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) алу үшін гомозиготалы Mfn2loxP/Mfn2loxP тышқандарымен будандастырылды. Шабыттандырудың ішкі жиынтығында Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллелі (stop-mtYFP) қосымша будандастырулар арқылы енгізілді (20). Жануарлармен жүргізілетін барлық процедуралар еуропалық, ұлттық және институционалдық нұсқауларға сәйкес орындалды және Германияның Солтүстік Рейн-Вестфалия штатындағы Умвельт және Вербраухершутц қалаларындағы LandesamtfürNatur компаниясымен бекітілді. Жануарлармен жұмыс сонымен қатар Еуропалық зертханалық жануарлар ғылымдары қауымдастықтары федерациясының басшылығымен жүзеге асырылады.
Жүкті әйелдің жатыр мойнының шығуын анестезиялағаннан кейін тышқан эмбрионы бөлініп алынады (E13). Кортекс 10 мМ Хепес қосылған Хэнкс теңгерімді тұз ерітіндісінде (HBSS) бөлініп, папаин (20 U/мл) және цистеин (1 мкг/мл) бар Дульбекко модификацияланған бүркіт ортасына берілді. Тінді DMEM-де инкубациялап, ферментативті қорыту арқылы диссоциациялаңыз. Ml) 37°C температурада 20 минут бойы, содан кейін 10% ұрық сиырының сарысуымен қосылған DMEM-де механикалық түрде ұнтақтаңыз. Жасушалар 6 см культура ыдысына 2×106 тығыздықта немесе бейнелеу талдауы үшін 0,5×105 жасуша/см2 тығыздықта полилизинмен қапталған шыны қақпақтарға себілді. 4 сағаттан кейін орта 1% B27 қоспасы және 0,5 мМ GlutaMax бар нейробазальды сарысусыз ортамен ауыстырылды. Содан кейін нейрондар тәжірибе барысында 37°C температурада және 5% CO2 деңгейінде сақталды және аптасына бір рет қоректендірілді. In vitro рекомбинациясын индукциялау үшін in vitro екінші күні нейрондарды емдеу үшін келесі AAV9 вирус векторының 3 мкл (24 ұңғылы дақыл ыдысы) немесе 0,5 мкл (24 ұңғылы табақша) пайдаланылды: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталог нөмірі 105530-AAV9) және AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталог нөмірі 105545-AAV9).
Тышқанның Mfn1 және Mfn2 комплементарлы ДНҚ-сы (сәйкесінше Addgene плазмидасы №23212 және №23213) С-терминалында V5 тізбегімен (GKPIPNPLLGLDST) белгіленеді және T2A тізбегі арқылы кадрдағы mCherry-мен біріктіріледі. Grx1-roGFP2 - Гейдельберг Т.П. Дик DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) сыйлығы. tdTomato кассетасын дәстүрлі клондау әдістерін қолдана отырып ауыстыру арқылы кассета pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 және pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторларын жасау үшін pAAV-CAG-FLEX-tdTomato негізіне (Addgene анықтамалық нөмірі 28306) субклондалды. pAAV-CAG-FLEX-mCherry басқару векторын жасау үшін ұқсас стратегия қолданылды. AAV-shPCx конструкциясын жасау үшін плазмидалық AAV векторы (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) қажет, ол тышқан PCx нысанасына бағытталған shRNA кодтайтын ДНҚ тізбегін қамтиды (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAG 3′). U6 промоторының басқаруымен mCherry CMV промоторының басқаруымен қолданылады. Көмекші AAV векторларын өндіру өндірушінің нұсқауларына сәйкес жүзеге асырылды (Cell Biolabs). Қысқаша айтқанда, кальций фосфаты әдісін қолдана отырып, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) тасымалдайтын тасымалдау плазмидасын 293AAV жасушаларының-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) немесе Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодтайтын генді, сондай-ақ AAV1 капсидті ақуызды және қосымша ақуызды кодтайтын плазмидті қаптау плазмидасын кальций фосфаты әдісімен уақытша трансфекциялау үшін пайдаланыңыз. Шикі вирустың үстіңгі қабаты құрғақ мұз/этанол ваннасында мұздату-еріту циклдары арқылы алынды және жасушалар фосфат буферлі тұзды ерітіндіде (PBS) лизистелді. AAV векторы үзіліссіз йодиксанол градиентті ультрацентрифугалау арқылы тазартылды (32 000 айн/мин және 4°C температурада 24 сағат) және Amicon ультра-15 центрифугалау сүзгісін пайдаланып концентрацияланды. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 геном көшірмесі (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX геномының титрі бұрын сипатталғандай (54), нақты уақыт режиміндегі сандық ПТР (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) және AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл) арқылы өлшенді.
Бастапқы нейрондар мұздай суық 1x PBS-те қырылып алынып, түйіршіктерге бөлініп, содан кейін фосфатаза мен протеаза ингибиторы (Roche) бар 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS лизис буферінде гомогенделді. Ақуызды сандық анықтау бицинхонин қышқылы талдауын (Thermo Fisher Scientific) қолдану арқылы жүргізілді. Содан кейін ақуыздар SDS-полиакриламид гель электрофорезі арқылы бөлініп, поливинилиден фторидті мембранаға блотталды (GE Healthcare). Арнайы емес учаскелерді жауып, бастапқы антиденемен (толығырақ S1 кестесін қараңыз) 5% сүтте TBST-де (Tween қосылған Tris-буферленген тұзды ерітіндіде), жуу кезеңдерінде және TBST Incubate-те екінші реттік антиденемен инкубациялаңыз. Бастапқы антиденемен +4°C температурада түні бойы инкубациялаңыз. Жуғаннан кейін екінші реттік антиденені бөлме температурасында 2 сағат бойы жағыңыз. Кейіннен, сол блотты анти-β-актин антиденесімен инкубациялау арқылы сол жүктеме расталды. Хемилюминесценцияға түрлендіру және хемилюминесценцияны күшейту арқылы анықтау (GE Healthcare).
Бұрын шыны қақпақтарға себілген нейрондар көрсетілген уақыт нүктесінде бөлме температурасында 10 минут бойы 4% параформальдегид (PFA)/PBS ерітіндісімен бекітілді. Алдымен қақпақтарға бөлме температурасында 5 минут бойы 0,1% Triton X-100/PBS ерітіндісі енгізілді, содан кейін блоктау буферінде [3% ірі қара малдың сарысу альбумині (BSA)/PBS] енгізілді. Екінші күні қақпақтар блоктау буферімен жуылып, тиісті флуороформен конъюгацияланған екінші реттік антиденемен бөлме температурасында 2 сағат бойы инкубацияланды; соңында үлгілер PBS ерітіндісінде мұқият жуылып, 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI) қарсы бояумен боялды, содан кейін микроскоптық слайдқа Aqua-Poly/Mount ерітіндісімен бекітілді.
Тышқандарға (еркек және ұрғашы) кетамин (130 мг/кг) және ксилазин (10 мг/кг) ішперде ішіне енгізу арқылы анестезия жасалды және карпрофен анальгетикімен (5 мг/кг) тері астына енгізілді. Және жылы төсеммен жабдықталған стереотаксикалық құралға (Kopf) орналастырылды. Бас сүйегін ашып, мишық қыртысының ми сүйегіне сәйкес келетін бөлігін жұқарту үшін тіс бұрғысын пайдаланыңыз (лямбдадан: құйрық 1.8, бүйір 1, IV және V бөлікшелеріне сәйкес келеді). Төмендегі тамыр жүйесін бұзбау үшін бас сүйегінде кішкентай тесік жасау үшін иілген шприц инесін пайдаланыңыз. Содан кейін жұқа тартылған шыны капилляр микротесікке баяу енгізіледі (қатты қабықтың вентральды жағында -1.3-тен -1-ге дейін) және 200-ден 300 нл-ге дейінгі AAV қолмен шприцтермен (Наришиге) микроинжекторға (Наришиге) 10-20 минут аралығында төмен қысыммен бірнеше рет енгізіледі. Инфузиядан кейін, вирустың толық таралуы үшін капиллярды тағы 10 минутқа қойыңыз. Капиллярлар алынып тасталғаннан кейін, жараның қабынуын азайту және жануардың қалпына келуі үшін тері мұқият тігіледі. Жануарларға операциядан кейін бірнеше күн бойы ауырсынуды басатын дәрілер (каспофен) берілді, осы уақыт ішінде олардың физикалық жағдайы мұқият бақыланды, содан кейін көрсетілген уақытта эвтаназия жасалды. Барлық процедуралар еуропалық, ұлттық және институционалдық нұсқауларға сәйкес жүргізілді және Германияның Солтүстік Рейн-Вестфалия штатындағы Умвельт және Вербраухершутц қаласындағы LandesamtfürNatur компаниясымен мақұлданды.
Жануарларға кетамин (100 мг/кг) және ксилазин (10 мг/кг) арқылы анестезия жасалды, ал жүрек алдымен 0,1 М PBS, содан кейін PBS-те 4% PFA енгізілді. Тін бөлініп, 4°C температурада түні бойы 4% PFA/PBS енгізілді. PBS-те бекітілген мидан сагитталды кесінділерді (қалыңдығы 50 мкм) дайындау үшін дірілдейтін пышақ (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) қолданылды. Басқаша көрсетілмесе, еркін қалқымалы кесінділерді бояу жоғарыда сипатталғандай (13) бөлме температурасында және араластыру арқылы жүргізілді. Қысқасы, алдымен алынған кесінділер бөлме температурасында 15 минут бойы 0,5% Triton X-100/PBS енгізілді; кейбір эпитоптар үшін (Pcx және Shmt2) 80°C температурада (рН 9) трис-ЭДТА буферінде кесінділерді осы қадамның орнына 25 минут қыздырыңыз. Әрі қарай, кесінділер бастапқы антиденемен (S1 кестесін қараңыз) 4°C температурада араластыра отырып, түні бойы инкубацияланды. Келесі күні кесінділер блоктау буферімен жуылып, тиісті флуороформен конъюгацияланған екінші реттік антиденемен бөлме температурасында 2 сағат бойы инкубацияланды; соңында, кесінділер PBS-те мұқият жуылып, DAPI-мен боялып, содан кейін микроскоптық слайдта AquaPolymount-пен бекітілді.
Үлгіні бейнелеу үшін ақ жарық лазерімен және 405 диодты ультракүлгін лазермен жабдықталған лазерлік сканерлеуші ​​конфокальды микроскоп (TCS SP8-X немесе TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) пайдаланылды. Флуорофорды қоздырып, сигналды гибридті детектормен (HyDs) жинау арқылы LAS-X бағдарламалық жасақтамасы тізбекті режимде Nyquist іріктеуіне сәйкес келетін қабатталған кескіндерді жинау үшін пайдаланылды: сандық емес панельдер үшін бұл жоғары динамикалық сигналдар (мысалы, соматикалық жасушалар мен дендриттерде) mtYFP) BrightR режимінде PN санын анықтау үшін HyD пайдаланыңыз). Фонды азайту үшін 0,3-тен 6 нс-ке дейінгі қақпалау қолданылады.
Сұрыпталған жасушаларды нақты уақыт режимінде бейнелеу. 1% B27 қоспасы және 0,5 мМ GlutaMax бар Neurobasal-A ортасында сұрыптағаннан кейін, жасушалар дереу поли-l-лизинмен қапталған шыны слайдтарға (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталог нөмірі 80826) себілді, содан кейін жасушалардың шөгуіне мүмкіндік беру үшін оны 37°C температурада және 5% CO2 температурада 1 сағат ұстаңыз. Нақты уақыт режимінде бейнелеу ақ лазермен, HyD, 63×[1,4 сандық диафрагма (NA)] майлы объективпен және қыздыру сатысымен жабдықталған Leica SP8 лазерлік сканерлеу конфокальды микроскопында орындалды.
Тышқанға көмірқышқыл газымен тез арада анестезия жасалып, басы кесілді, миы бас сүйегінен тез арада алынып, қалыңдығы 200 мкм (13C таңбалау эксперименті үшін) немесе қалыңдығы 275 мкм (екі фотон эксперименті үшін) сагитталдық кесіндіге кесілді, оған келесі материалдар толтырылды. Балмұздақ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Уолдорф, Германия) келесі заттармен толтырылған: 125 мМ мұздай, көміртегімен қаныққан (95% O2 және 5% CO2) төмен Ca2 + жасанды жұлын сұйықтығы (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкоза, 0,5 мМ CaCl2 және 3,5 мМ MgCl2 (осмостық қысымы 310-нан 330 ммольге дейін). Алынған ми кесектерін құрамында Ca2 + ACSF жоғары (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 және 2,0 мМ MgCl2) орташа (рН 7,4 және 310-нан 320 ммольге дейін) бар инкубация алдындағы камераға ауыстырыңыз.
Бейнелеу процесі кезінде кесінділер арнайы бейнелеу бөлмесіне ауыстырылды, ал тәжірибе 32°-тан 33°C-қа дейінгі тұрақты температурада үздіксіз ACSF перфузиясы астында жүргізілді. Кесіндіні бейнелеу үшін Leica 25x объективімен (NA 0.95, су), Ti: Sapphire лазерімен (Chameleon Vision II, Coherent) жабдықталған көпфотонды лазерлік сканерлеу микроскопы (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) пайдаланылды. FLIM модулі (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 FLIM. PN цитоплазмалық тотығу-тотықсыздану күйіндегі өзгерістер сагиттальды ми кесінділеріндегі екі фотонды FLIM арқылы өлшенді, мұнда Grx1-roGFP2 биосенсоры PN-дерді нысанаға алды. PN қабатында өміршең PN (яғни, моншақ тәрізді құрылымның немесе дендриттер бойында нейрондық морфологиялық өзгерістердің болмауы) және қос оң roGFP2 сенсоры мен shRNA PCx немесе оның басқару тізбегін кодтайтын AAV (әрқайсысы mCherry-ді бірлесіп экспрессиялайды) бар екеніне көз жеткізу үшін кесінді бетінен шамамен 50-ден 80 мкм-ге дейін алу өрісі таңдалады. 2x сандық масштабтаумен бір қабатты кескіндерді жинаңыз [қоздыру толқын ұзындығы: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Анықтау: ішкі HyD, флуоресцеин изотиоцианаты (FITC) сүзгі тобы] және қисық сызықты сәйкестендіру үшін жеткілікті фотондар жиналғанын (барлығы 1000 фотон) қамтамасыз ету үшін 2-3 минут ішінде орташаланған кескін қолданылады. Grx1-roGFP2 зондының сезімталдығы және FLIM жағдайларын тексеру перфузиялық ACSF-ке экзогенді 10 мМ H2O2 қосқан кезде roGFP2 өмір сүру ұзақтығының мәнін бақылау (тотығуды барынша арттыру үшін, нәтижесінде өмір сүру ұзақтығының артуы), содан кейін 2 мМ дитиотреитол қосу (тотықсыздану дәрежесін азайтады, нәтижесінде өмір сүру ұзақтығының азаюы) арқылы жүзеге асырылды (S8, D-ден G-ге дейінгі сурет). Алынған нәтижелерді талдау үшін FLIMfit 5.1.1 бағдарламалық жасақтамасын пайдаланыңыз, бүкіл кескіннің бір экспоненциалды ыдырау қисығын өлшенген IRF-ке (құралдың жауап беру функциясы) сәйкестендіріңіз, сонда χ2 шамамен 1-ге тең болады. Бір PN-нің өмір сүру ұзақтығын есептеу үшін жүйке денесінің айналасындағы маска қолмен салынды, ал әрбір маскадағы орташа өмір сүру ұзақтығы сандық бағалау үшін пайдаланылды.
Митохондриялық потенциалды талдау. Жедел бөлім перфузияланған ACSF-ке тікелей қосылған 100 нМ TMRM-мен 30 минут бойы инкубацияланғаннан кейін, PN-дердің митохондриялық потенциал өзгерістері екі фотонды микроскоппен өлшенді. TMRM бейнелеуі зондты 920 нм-де қоздыру және сигналдарды жинау үшін ішкі HyD (тетраметилродамин изотиоцианаты: 585/40 нм) пайдалану арқылы орындалды; бірдей қоздыру толқын ұзындығын пайдалану арқылы, бірақ mtYFP кескінін жасау үшін басқа ішкі HyD (FITC:525/50) пайдалану арқылы. Бір жасуша деңгейінде митохондриялық потенциалды бағалау үшін ImageJ-дің Image Calculator плагинін пайдаланыңыз. Қысқаша айтқанда, сәйкес арнаның бір қабатты конфокальды кескінінде Пуркинье Сомалидегі TMRM сигналын көрсететін митохондриялық аймақты анықтау үшін плагин теңдеуі: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) қолданылады. Содан кейін алынған маскадағы пиксель ауданы сандық түрде анықталады, содан кейін митохондриялық потенциалды көрсететін митохондриялық фракцияны алу үшін mtYFP арнасының сәйкес шекті бір қабатты кескінінде қалыпқа келтіріледі.
Сурет Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) бағдарламалық жасақтамасымен өңделді. Плиткалардың сканерленген суреттері үшін бір плитканы монтаждау LAS-X бағдарламалық жасақтамасы ұсынған автоматты тігу алгоритмін пайдаланып жасалады. Суретті калибрлегеннен кейін, суретті одан әрі өңдеу және жарықтық пен контрастты біркелкі реттеу үшін ImageJ және Adobe Photoshop бағдарламаларын пайдаланыңыз. Графикалық дайындау үшін Adobe Illustrator пайдаланыңыз.
мтДНҚ фокустық талдауы. мтДНҚ зақымдануларының саны конфокальды микроскоп арқылы ДНҚ-ға қарсы антиденелермен белгіленген мишық бөліктерінде сандық анықталды. Әрбір нысана аймағы жасуша денесі мен әрбір жасушаның ядросы үшін жасалды және тиісті аймақ Multi Measure плагинін (ImageJ бағдарламалық жасақтамасы) пайдаланып есептелді. Цитоплазмалық аймақты алу үшін жасуша денесі аймағынан ядролық аймақты алып тастаңыз. Соңында, табалдырық кескінінде мтДНҚ-ны көрсететін цитоплазмалық ДНҚ нүктелерін автоматты түрде сандық анықтау үшін Analyse Particles плагині (ImageJ бағдарламалық жасақтамасы) пайдаланылды және алынған нәтижелер CTRL тышқандарының PN орташа мәніне қалыпқа келтірілді. Нәтижелер жасушадағы нуклеозидтердің орташа саны ретінде көрсетіледі.
Ақуыз экспрессиясын талдау. PN-дегі ақуыз экспрессиясын бір жасуша деңгейінде бағалау үшін ImageJ-дің Image Calculator плагинін пайдаланыңыз. Қысқаша айтқанда, сәйкес арнаның бір қабатты конфокальды кескінінде, сигнал = мин (mtYFP, антидене) теңдеуі арқылы Пуркинадағы белгілі бір антиденеге иммунореактивтілікті көрсететін митохондриялық аймақ анықталады. Содан кейін алынған маскадағы пиксель аймағы сандық түрде анықталады, содан кейін көрсетілген ақуыздың митохондриялық фракциясын алу үшін mtYFP арнасының сәйкес шекті бір қабатты кескінінде қалыпқа келтіріледі.
Пуркинье жасушаларының тығыздығын талдау. ImageJ бағдарламасының Cell Counter плагині саналған Пуркинье жасушаларының санын саналған жасушалар алып жатқан мишық сақинасының ұзындығына бөлу арқылы Пуркинье тығыздығын бағалау үшін пайдаланылды.
Үлгі дайындау және жинау. Бақылау тобы мен Mfn2cKO тышқандарының миы 0,1 М фосфат буферінде (ПФ) 2% ПФА/2,5% глутаральдегидте бекітілді, содан кейін корональды кесінділер инфузорияларды (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) пайдаланып дайындалды (қалыңдығы 50-ден 60 мкм-ге дейін). Содан кейін ПФ буферінде бөлме температурасында 1% os тетраоксидінде және 1,5% калий ферроцианидінде 1 сағат бойы бекітілді. Кесінділер дистилденген сумен үш рет жуылды, содан кейін 20 минут бойы 1% уранил ацетаты бар 70% этанолмен боялды. Содан кейін кесінділер сұрыпталған спиртте сусыздандырылып, кремниймен қапталған шыны слайдтар арасына Durcupan ACM (Araldite құю шайыры M) эпоксидті шайырына (Electron Microscopy Sciences, каталог нөмірі 14040) енгізілді, соңында 60°C температурада пеште 48 сағат бойы полимерлендірілді. Мишық қыртысының аймағы таңдалып, 50 нм ультражұқа кесінділер Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) құрылғысында кесіліп, полистирол пленкасымен жабылған 2×1 мм мыс саңылауы торында іріктелді. Кесінділер 10 минут бойы H2O-дағы 4% уранил ацетат ерітіндісімен боялды, H2O-мен бірнеше рет жуылды, содан кейін H2O-дағы Рейнольдс қорғасын цитратымен 10 минут бойы жуылды, содан кейін H2O-мен бірнеше рет жуылды. Микрографтар Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АҚШ) трансмиссиялық электронды микроскопымен TVIPS (Tietz бейне және кескін өңдеу жүйесі) TemCam-F416 сандық камерасын (TVIPS GmbH, Гаутинг, АҚШ) пайдаланып түсірілді.
AAV жұқтырған тышқандар үшін ми бөлініп, қалыңдығы 1 мм сагитталды бөлікке кесілді, ал мишық AAV жұқтырған сақинаны (яғни, mCherry экспрессиясын) анықтау үшін флуоресцентті микроскопты пайдаланып тексерілді. Тек AAV инъекциясы кем дегенде екі қатарынан мишық сақинасындағы Пуркинье жасуша қабатының (яғни, бүкіл қабаттың) өте жоғары трансдукция тиімділігіне әкелетін тәжірибелер қолданылады. AAV арқылы трансдукцияланған ілмек түні бойы бекітілгеннен кейін микродиссекцияланды (0,1 М какаот буферінде 4% PFA және 2,5% глутаральдегид) және одан әрі өңделді. EPON енгізу үшін бекітілген тін 0,1 М натрий какаот буферімен (Applichem) жуылды және 0,1 М натрий какаот буферінде (Applichem) 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 4 сағат бойы инкубацияланды, содан кейін 2 сағат бойы жуылды. 0,1 М кокамид буферімен 3 рет қайталаңыз. Кейіннен этанолдың өсуші қатары әрбір этанол ерітіндісін 4°C температурада 15 минут бойы инкубациялау үшін тіндерді сусыздандыру үшін пайдаланылды. Тін пропилен оксидіне ауыстырылып, EPON (Sigma-Aldrich) ішінде 4°C температурада түні бойы инкубацияланды. Тінді бөлме температурасында жаңа EPON-ға 2 сағатқа қойып, содан кейін 62°C температурада 72 сағат бойы енгізді. 70 нм ультражұқа кесінділерді кесу үшін ультрамикротомды (Leica Microsystems, UC6) және гауһар пышақты (Diatome, Biel, Швейцария) пайдаланыңыз және 37°C температурада 15 минут бойы 1,5% уранил ацетатымен бояңыз, ал 4 минут бойы қорғасын цитраты ерітіндісімен бояңыз. Электронды микрографтар Camera OneView 4K 16-биттік (Gatan) және DigitalMicrograph бағдарламалық жасақтамасымен (Gatan) жабдықталған JEM-2100 Plus беріліс электронды микроскопын (JEOL) пайдаланып түсірілді. Талдау үшін 5000 × немесе 10 000 × сандық зуммен электронды микрографтар алынды.
Митохондриялықтардың морфологиялық талдауы. Барлық талдаулар үшін жеке митохондриялықтардың контурлары ImageJ бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып сандық кескіндерде қолмен белгіленді. Әртүрлі морфологиялық параметрлер талданады. Митохондриялық тығыздық әрбір жасушаның жалпы митохондриялық ауданын цитоплазма ауданына бөлу арқылы алынған пайызбен көрсетіледі (цитоплазма ауданы = жасуша ауданы-жасуша ядросының ауданы) × 100. Митохондриялықтардың дөңгелектігі [4π∙(аудан/периметр 2)] формуласымен есептеледі. Митохондриялықтардың ista морфологиясы талданып, негізгі пішіндеріне сәйкес екі санатқа («түтікшелі» және «көпіршік») бөлінді.
Аутофагосома/лизосома саны және тығыздық талдауы. Сандық кескіндегі әрбір аутофагосома/лизосоманың контурларын қолмен белгілеу үшін ImageJ бағдарламалық жасақтамасын пайдаланыңыз. Аутофагосома/лизосома ауданы әрбір жасушаның жалпы аутофагосома/лизосома құрылымының ауданын цитоплазма ауданына бөлу арқылы есептелетін пайызбен көрсетіледі (цитоплазма ауданы=жасуша ауданы-ядро ауданы)×100. Аутофагосомалардың/лизосомалардың тығыздығы жалпы санды жасушадағы аутофагосома/лизосома құрылымдарының санына бөлу арқылы есептеледі (цитоплазмалық аудан = жасуша ауданы-ядро ауданы).
Жедел кесінділерді кесу және үлгі дайындау үшін таңбалау. Глюкозаны таңбалауды қажет ететін тәжірибелер үшін жедел ми кесінділерін қаныққан көміртегі (95% O2 және 5% CO2), жоғары Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 және 2,0 мМ MgCl2, рН 7,4-ке және 310-нан 320 мОсм-ге дейін реттелген) бар инкубация алдындағы камераға ауыстырыңыз, онда глюкоза 13C6- Глюкозаны алмастыру (Eurisotop, каталог нөмірі CLM-1396). Пируватпен таңбалауды қажет ететін тәжірибелер үшін мидың өткір кесектерін жоғары Ca2 + ACSF-ке (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2) ауыстырып, 2,0 мМ MgCl2 қосып, рН 7,4 және 310-нан 320 мОсм-ге дейін реттеңіз) және 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталог нөмірі CLM-1082) қосыңыз. Кесінділерді 37°C температурада 90 минут инкубациялаңыз. Тәжірибе соңында кесінділер 75 мМ аммоний карбонаты бар сулы ерітіндімен (рН 7,4) тез жуылып, содан кейін 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилінде (ACN): метанол: суда гомогенделді. Бөліктер мұзда 30 минут инкубацияланғаннан кейін, үлгілер 21 000 г температурада 10 минут бойы 4°C температурада центрифугаланды, ал мөлдір үстіңгі қабат SpeedVac концентраторында кептірілді. Алынған кептірілген метаболит түйіршігі талдау жасалғанға дейін -80°C температурада сақталды.
13 С-таңбаланған аминқышқылдарының сұйық хроматография-масс-спектрометрия талдауы. Сұйық хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS) талдауы үшін метаболит түйіршігі 75 мкл LC-MS сұрыпты суда (Honeywell) қайта ерітілді. 21 000 г температурада 4°C температурада 5 минут бойы центрифугалағаннан кейін, аминқышқыл ағынын талдау үшін 20 мкл тазартылған супернатант пайдаланылды, ал қалған сығынды бірден анионды талдау үшін пайдаланылды (төменде қараңыз). Аминқышқылын талдау бұрын сипатталған бензоилхлоридті туындылау хаттамасын қолдану арқылы жүргізілді (55, 56). Бірінші қадамда 20 мкл метаболит сығындысына 10 мкл 100 мМ натрий карбонаты (Sigma-Aldrich) қосылды, содан кейін LC сұрыпты ACN-ге 10 мкл 2% бензоилхлориді (Sigma-Aldrich) қосылды. Үлгі қысқа уақытқа вискозаланып, содан кейін 21 000 г температурада 20°C температурада 5 минут бойы центрифугаланды. Тазартылған супернатант конус тәрізді шыны қондырмасы бар (200 мкл көлемі) 2 мл автоүлгілеуші ​​құтыға ауыстырылды. Үлгілер Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) жоғары ажыратымдылықтағы дәлдіктегі масс-спектрометріне (Thermo Fisher Scientific) қосылған Acquity iClass ультра жоғары өнімді LC жүйесі (Waters) арқылы талданды. Талдау үшін алынған үлгінің 2 мкл мөлшері 1,8 мкм бөлшектері бар 100 × 1,0 мм жоғары беріктіктегі кремний диоксиді T3 бағанына (Waters) енгізілді. Ағын жылдамдығы 100 мкл/мин, ал буферлік жүйе A буферінен (10 мМ аммоний форматы және судағы 0,15% құмырсқа қышқылы) және B буферінен (ACN) тұрады. Градиент келесідей: 0 минутта 0%B; 0%B. 0-ден 0,1 минутқа дейін 0-ден 15% -ға дейін B; 0,1-ден 0,5 минутқа дейін 15-тен 17% -ға дейін B; 0,5-тен 14 минутқа дейін 17-ден 55% -ға дейін B; 14-тен 14,5 минутқа дейін 55-тен 70% -ға дейін B; 18 минутта 14,5-тен 70-ке дейін 100% -ға дейін B; 18-ден 19 минутқа дейін 100% -ға дейін B; 19-дан 19,1 минутқа дейін 100-ден 0% -ға дейін B; 19,1-ден 28 минутқа дейін 0% B (55, 56). QE-HF массалық спектрометрі оң иондану режимінде m/z (масса/заряд қатынасы) масса диапазонында 50-ден 750-ге дейін жұмыс істейді. Қолданылған ажыратымдылық 60 000, ал алынған күшейту басқаруы (AGC) ион нысанасы 3 × 106, ал максималды ион уақыты 100 миллисекунд. Қыздырылған электроспрей иондану (ESI) көзі 3,5 кВ шашыратқыш кернеуде, 250°C капиллярлық температурада, 60 AU қабықша ауа ағынында (еркін бірліктер) және 20 AU 250°C қосалқы ауа ағынында жұмыс істейді. S линзасы 60 AU-ға орнатылған.
13C белгіленген органикалық қышқылдардың анион хроматографиясы-MS талдауы. Қалған метаболит тұнбасы (55 мкл) QE-HF масс-спектрометріне (Thermo Fisher Scientific) қосылған Dionex ион хроматография жүйесі (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) арқылы талданды. Қысқасы, 5 мкл метаболит сығындысы HPLC (2 мм×250 мм, бөлшектердің өлшемі 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) жабдықталған Dionex IonPac AS11-HC бағанына толтыру коэффициенті 1 болатын итеру-кіру ішінара цикл режимінде енгізілді.) Dionex IonPac AG11-HC қорғаныш бағанасы (2 мм x 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Баған температурасы 30°C температурада сақталады, ал автоүлгі 6°C-қа орнатылған. Элюент генераторы арқылы калий гидроксиді градиентін жасау үшін деионизацияланған сумен жабдықталған калий гидроксиді картриджін пайдаланыңыз. Метаболиттерді бөлу 380 мкл/мин ағын жылдамдығымен, келесі градиентті қолдану арқылы жүзеге асырылды: 0-ден 3 минутқа дейін, 10 мМ KOH; 3-тен 12 минутқа дейін, 10-нан 50 мМ KOH; 12-ден 19 минутқа дейін, 50-ден 100 мМ KOH; 19-дан 21 минутқа дейін, 100 мМ KOH; 21-ден 21,5 минутқа дейін, 100-ден 10 мМ KOH. Баған 10 мМ KOH астында 8,5 минут бойы қайта теңестірілді.
Элюцияланған метаболиттер бағаннан кейін 150 мкл/мин изопропанол қоспасының ағынымен біріктіріледі, содан кейін теріс иондану режимінде жұмыс істейтін жоғары ажыратымдылықтағы масс-спектрометрге бағытталады. MS масса диапазонын m/z 50-ден 750-ге дейін 60 000 ажыратымдылықпен бақылайды. AGC 1 × 106-ға орнатылған, ал максималды ион уақыты 100 мс-та сақталады. Қыздырылған ESI көзі 3,5 кВ шашыратқыш кернеуде жұмыс істеді. Ион көзінің басқа параметрлері келесідей: капиллярлық температура 275°C; қабық газының ағыны, 60 AU; қосалқы газ ағыны, 300°C температурада 20 AU және S линзасын 60 AU-ға орнату.
13C белгіленген метаболиттерінің деректерін талдау. Изотоп қатынасының деректерін талдау үшін TraceFinder бағдарламалық жасақтамасын (4.2 нұсқасы, Thermo Fisher Scientific) пайдаланыңыз. Әрбір қосылыстың сәйкестігі сенімді анықтамалық қосылыспен тексеріліп, тәуелсіз талданды. Изотоптарды байыту талдауын жүргізу үшін әрбір 13C изотопының (Mn) алынған иондық хроматограммасының (XIC) ауданы [M + H]+ -дан алынды, мұндағы n - аминқышқылдарын талдау үшін пайдаланылатын мақсатты қосылыстың көміртегі саны немесе аниондарды талдау үшін [MH]+ пайдаланылады. XIC массалық дәлдігі миллионға бес бөліктен аз, ал RT дәлдігі 0,05 минут. Байыту талдауы әрбір анықталған изотоптың сәйкес қосылыстың барлық изотоптарының қосындысына қатынасын есептеу арқылы жүзеге асырылады. Бұл қатынастар әрбір изотоп үшін пайыздық мәндер ретінде беріледі, ал нәтижелер бұрын сипатталғандай (42) молярлық пайыздық байыту (MPE) ретінде көрсетіледі.
Мұздатылған нейрон түйіршігі мұздай суық 80% метанолда (көлем/көлем) гомогенделіп, араластырылып, -20°C температурада 30 минут инкубацияланды. Үлгіні қайтадан араластырып, +4°C температурада 30 минут араластырыңыз. Үлгі 21 000 г температурада 4°C температурада 5 минут центрифугаланды, содан кейін алынған супернатант жиналып, SpeedVac концентраторын пайдаланып 25°C температурада кептірілді. Жоғарыда сипатталғандай, сұрыпталған жасушалардың аминқышқылдарына LC-MS талдауы жүргізілді. TraceFinder (4.2 нұсқасы, Thermo Fisher Scientific) көмегімен деректерді талдау әрбір қосылыстың моноизотоптық массасын пайдаланып жүргізілді. Метаболит деректерін кванттық нормалау preprocessCore бағдарламалық пакетін (57) пайдаланып жүргізілді.
Кесінді дайындау. Тышқан көмірқышқыл газымен тез арада жансыздандырылып, басы кесілді, миы бас сүйегінен тез алынып тасталды, ал мұз толтырылған дірілдейтін пышақпен (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия) оны 300-ден 375 мкм-ге дейінгі сагитталдық кесінділерге кесу үшін пайдаланылды. Суық көміртекті газдандыру (95% O2 және 5% CO2) Төмен Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 және 6,0 мМ MgCl2 рН 7,4 және 310-нан 330 мОсм-ге дейін реттеңіз). Алынған ми кесектерін рН 7,4 және 310-нан 320 мОсм-ге дейін Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфері, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 4,0 мМ CaCl2 және mM 3,5 MgCl2) жоғары рН бар камераға салыңыз. Кесінділерді жазу алдында қалпына келтіру үшін 20-30 минут сақтаңыз.
жазу. Барлық жазулар үшін бекітілген жазу камерасымен және 20x суға батырылатын объективті линзамен (Scientifica) жабдықталған микроскоп сатысы пайдаланылды. Болжамды Пуркинье жасушалары (i) дене өлшемі, (ii) мишықтың анатомиялық орналасуы және (iii) флуоресцентті mtYFP репортер генінің экспрессиясы бойынша анықталды. Ұшына кедергісі 5-тен 11 мегомға дейінгі патч пипеткасын боросиликат шыны капилляры (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Германия) және көлденең пипетка Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA арқылы шығарады. Барлық жазбалар Signal бағдарламалық жасақтамасымен (6.0 нұсқасы, Cambridge Electronic, Кембридж, Ұлыбритания) басқарылатын ELC-03XS npi патч қысқыш күшейткіші (npi electronic GmbH, Tam, Германия) арқылы орындалды. Тәжірибе 12,5 кГц дискретизация жиілігінде жазылды. Сигнал сәйкесінше 1,3 және 10 кГц кесу жиіліктері бар екі қысқа жиілікті Бессель сүзгісімен сүзіледі. Мембрана мен пипетканың сыйымдылығы күшейткішті пайдаланып компенсациялық тізбекпен өтеледі. Барлық тәжірибелер Hokawo бағдарламалық жасақтамасымен (2.8 нұсқасы, Хамаматсу, Герден, Германия) басқарылатын Orca-Flash 4.0 камерасының (Хамаматсу, Герден, Германия) басқаруымен жүргізілді.
Тұтас жасуша конфигурациясы және талдауы. Жазу алдында бірден пипетканы келесі заттар бар ішкі ерітіндімен толтырыңыз: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ калий глюконаты, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ ATP (Mg), 0,5 мМ Гуанозин трифосфаты (GTP) (Na) және 10,0 мМ креатинин фосфаты рН 7,25-ке дейін реттелді, ал осмостық қысым 290 мОсм (сахароза) болды. Мембрананы жару үшін 0 пА күш қолданғаннан кейін бірден тыныштықтағы мембрана потенциалы өлшенді. Кіріс кедергісі -40, -30, -20 және -10 пА гиперполяризацияланған токтарды қолдану арқылы өлшенеді. Кернеу реакциясының шамасын өлшеңіз және кіріс кедергісін есептеу үшін Ом заңын қолданыңыз. Өздігінен пайда болған белсенділік кернеу қысқышында 5 минут бойы жазылды, ал sPSC Igor Pro (32 7.01 нұсқасы, WaveMetrics, Лейк Освего, Орегон, АҚШ) бағдарламасында жартылай автоматты тану скриптін пайдаланып анықталып, өлшенді. IV қисығы мен тұрақты күйдегі ток батареяны әртүрлі потенциалдарда (-110 мВ-тан бастап) қысу және кернеуді 5 мВ қадамдармен арттыру арқылы өлшенеді. AP өндірісі деполяризациялаушы токты қолдану арқылы тексерілді. Деполяризациялаушы ток импульсін қолдану кезінде ұяшықты -70 мВ-қа қысыңыз. Әрбір жазу құрылғысының қадам өлшемін бөлек реттеңіз (10-нан 60 пА-ға дейін). Ең жоғары AP жиілігін тудыратын импульстік секірістерді қолмен санау арқылы максималды AP жиілігін есептеңіз. AP шегі бір немесе бірнеше AP-ны бірінші іске қосатын деполяризациялау импульсінің екінші туындысын пайдалану арқылы талданады.
Перфорацияланған патч конфигурациясы және талдауы. Стандартты хаттамаларды пайдаланып, перфорацияланған патч жазуын орындаңыз. Келесі ингредиенттерді қамтымайтын АТФ және ГТФ-сыз пипетканы пайдаланыңыз: 128 мМ глюконат K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA және 2 мМ MgCl2 және рН 7,2-ге дейін реттеңіз (KOH пайдаланып). Жасуша мембранасының бақыланбайтын өткізгіштігін болдырмау үшін АТФ және ГТФ жасушаішілік ерітіндіден алынып тасталады. Патч пипеткасына амфотерицин бар ішкі ерітінді (шамамен 200-ден 250 мкг/мл-ге дейін; G4888, Sigma-Aldrich) толтырылады, бұл тесілген патч жазбасын алуға мүмкіндік береді. Амфотерицин диметилсульфоксидте ерітілді (соңғы концентрациясы: 0,1-ден 0,3% -ға дейін; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Қолданылған DMSO концентрациясы зерттелген нейрондарға айтарлықтай әсер еткен жоқ. Тесу процесінде арна кедергісі (Ra) үздіксіз бақыланды, ал Ra мен AP амплитудасы тұрақтанғаннан кейін (20-40 минут) тәжірибе басталды. Өздігінен пайда болатын белсенділік кернеу және/немесе ток қысқышында 2-ден 5 минутқа дейін өлшенеді. Деректерді талдау Igor Pro (7.05.2 нұсқасы, WaveMetrics, АҚШ), Excel (2010 нұсқасы, Microsoft Corporation, Редмонд, АҚШ) және GraphPad Prism (8.1.2 нұсқасы, GraphPad Software Inc., Ла-Холья, Калифорния) бағдарламаларын пайдаланып жүргізілді. Өздігінен пайда болатын AP-ларды анықтау үшін IgorPro компаниясының NeuroMatic v3.0c плагині қолданылады. Әрбір жазба үшін жеке реттелетін берілген шекті пайдаланып, AP-ларды автоматты түрде анықтаңыз. Шың аралығын пайдаланып, шың жиілігін максималды лездік шың жиілігімен және орташа шың жиілігімен анықтаңыз.
PN оқшаулау. Бұрын жарияланған хаттамаға бейімделу арқылы PN-дер тышқанның мишықтан белгілі бір кезеңде тазартылды (58). Қысқасы, мишық мұздай суық диссоциация ортасында [HBSS Ca2+ және Mg2+ қосылмаған, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 ӘБ/мл) және стрептомицин (0,05 мг/мл) қосылған] бөлініп, ұсақталды, содан кейін орта папаинге сіңірілді [HBSS, 1-цистеин·HCl (1 мг/мл), папаин (16 ӘБ/мл) және дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0,1 мг/мл) қосылған]. 30°C температурада 30 минут бойы өңделді. Алдымен тіндерді жұмыртқа шырышы (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) және DNase (0,1 мг/мл) бар HBSS ортасында ферментативті ас қорытудың алдын алу үшін бөлме температурасында жуыңыз, содан кейін 20 мМ глюкозасы бар HBSS ортасында HBSS, пенициллин (50 U/мл), стрептомицин (0,05 мг/мл) және DNase (0,1 мг/мл) ақырын ұнтақтап, жеке жасушаларды босатыңыз. Алынған жасуша суспензиясы 70 мкм жасуша сүзгісі арқылы сүзілді, содан кейін жасушалар центрифугалау арқылы түйіршіктелді (1110 айн/мин, 5 минут, 4°C) және сұрыптау ортасында қайта суспензияланды [HBSS, 20 мМ глюкоза, 20% ұрық сиыры) сарысуымен, пенициллинмен (50 U/мл) және стрептомицинмен (0,05 мг/мл) толықтырылды]; жасушаның тіршілік қабілетін пропидий йодидімен бағалаңыз және жасуша тығыздығын 1×106-дан 2×106 жасуша/мл-ге дейін реттеңіз. Ағынды цитометрия алдында суспензия 50 мкм жасуша сүзгісі арқылы сүзілді.
Ағынды цитометр. Жасушаны сұрыптау 4°C температурада FACSAria III аппаратын (BD Biosciences) және FACSDiva бағдарламалық жасақтамасын (BD Biosciences, 8.0.1 нұсқасы) пайдаланып жүргізілді. Жасуша суспензиясы 100 мкм саптаманы пайдаланып, 20 psi қысыммен ~2800 оқиға/сек жылдамдықпен сұрыпталды. Дәстүрлі қақпалау критерийлері (жасуша өлшемі, бимодальды ажырату және шашыраңқылық сипаттамалары) PN-ді басқа жасуша түрлерінен дұрыс оқшаулауды қамтамасыз ете алмайтындықтан, қақпалау стратегиясы mitoYFP+ ​​​​және басқару mitoYFP − тышқандарындағы YFP қарқындылығы мен автофлуоресценциясын тікелей салыстыруға негізделіп белгіленеді. YFP үлгіні 488 нм лазерлік сызықпен сәулелендіру арқылы қоздырылады және сигнал 530/30 нм жолақты өткізгіш сүзгіні пайдаланып анықталады. mitoYFP+ ​​​​тышқандарында Rosa26-mitoYFP репортер генінің салыстырмалы күші нейрондық дене мен аксон фрагменттерін ажырату үшін де қолданылады. 7-AAD 561 нм сары лазермен қоздырылады және өлі жасушаларды алып тастау үшін 675/20 нм жолақты сүзгімен анықталады. Астроциттерді бір уақытта бөлу үшін жасуша суспензиясы ACSA-2-APC-мен боялды, содан кейін үлгі 640 нм лазерлік сызықпен сәулелендірілді және сигналды анықтау үшін 660/20 нм жолақты сүзгі пайдаланылды.
Жиналған жасушалар центрифугалау арқылы түйіршіктерге бөлінді (1110 айн/мин, 5 минут, 4°C) және пайдаланылғанға дейін -80°C температурада сақталды. Процедуралық өзгергіштікті азайту үшін Mfn2cKO тышқандары мен олардың күшіктері сол күні жіктелді. FACS деректерін ұсыну және талдау FlowJo бағдарламалық жасақтамасын (FlowJo LLC, Ashland, Орегон, АҚШ) пайдаланып жүргізілді.
Жоғарыда айтылғандай (59), нақты уақыттағы ПТР кейіннен мтДНҚ сандық анықтау үшін сұрыпталған нейрондардан ДНҚ-ны бөліп алу үшін қолданылады. Сызықтық және шекті сезімталдық бастапқыда әртүрлі жасушаларда qPCR іске қосу арқылы тексерілді. Қысқаша айтқанда, 50 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Tween 20 және протеиназа K (200 нг/мл) тұратын лизис буферіне 300 PN жинап, 55°C температурада 120 минут инкубациялаңыз. Протеиназа K толық инактивациясын қамтамасыз ету үшін жасушалар 95°C температурада 10 минут бойы инкубацияланды. mt-Nd1-ге тән TaqMan зондын (Thermo Fisher) пайдаланып, мтДНҚ 7900HT нақты уақыттағы ПТР жүйесінде (Thermo Fisher Scientific) жартылай сандық ПТР арқылы өлшенді. Science, каталог нөмірі Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталог нөмірі AIVI3E8) және 18S (Thermo Fisher Scientific, каталог нөмірі Hs99999901_s1) гендер.
Протеом үлгісін дайындау. Ерітіндіні 95°C температурада 10 минут қыздырып, ультрадыбыстық әсер ету арқылы лизис буферінде [6 М гуанидин хлориді, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлориді, 10 мМ хлорацетамид және 100 мМ трис- HCl-де мұздатылған нейрон түйіршіктерін лизиске ұшыратады]. Bioruptor (Diagenode) құрылғысында 10 минут бойы (30 секунд импульс / 30 секунд үзіліс кезеңі). Үлгі 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) ерітіндісінде 1:10 қатынасында сұйылтылды, 300 нг трипсин алтынымен (Promega) араластырылды және толық қорытуға қол жеткізу үшін 37°C температурада түні бойы инкубацияланды. Екінші күні үлгі 20 000 г температурада 20 минут бойы центрифугаланды. Супернатант 0,1% құмырсқа қышқылымен сұйылтылды, ал ерітінді үйде жасалған StageTips көмегімен тұзсыздандырылды. Үлгі SpeedVac құралында (Eppendorf концентраторы плюс 5305) 45°C температурада кептірілді, содан кейін пептид 0,1% құмырсқа қышқылында суспензияланды. Барлық үлгілерді бір адам бір уақытта дайындады. Астроцит үлгілерін талдау үшін 4 мкг тұзсыздандырылған пептидтер 1:20 пептидтің TMT реактивіне қатынасы бар тандемдік масса белгісімен (TMT10plex, каталог нөмірі 90110, Thermo Fisher Scientific) белгіленді. TMT таңбалау үшін 0,8 мг TMT реактиві 70 мкл сусыз ACN-де қайта суспензияланды, ал кептірілген пептид 9 мкл 0,1 M TEAB (триэтиламмоний бикарбонаты)-ға қайта қалпына келтірілді, оған ACN-дегі 7 мкл TMT реактиві қосылды. Концентрациясы 43,75% болды. 60 минут инкубациядан кейін реакция 2 мкл 5% гидроксиламинмен сөндірілген. Белгіленген пептидтер жиналып, кептіріліп, 200 мкл 0,1% құмырсқа қышқылында (FA) қайта ерітіліп, екіге бөлініп, содан кейін үйде жасалған StageTips көмегімен тұзсыздандырылған. UltiMate 3000 ультра жоғары өнімді сұйық хроматографын (UltiMate 3000 ультра жоғары өнімді сұйық хроматограф) пайдаланып, екі жартысының бірі 130Å1,7μm C18 бөлшектерімен толтырылған 1мм x 150мм Acquity хроматографиялық бағанында фракцияланған (Waters, каталог № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Пептидтерді 30 мкл/мин ағын жылдамдығымен бөліңіз, 1%-дан 50%-ға дейінгі буфер B-ны 85 минут бойы сатылы градиентпен 96 минут бойы бөліңіз, 50%-дан 95%-ға дейінгі буфер B-ны 3 минут бойы бөліңіз, содан кейін 95% B буфері үшін 8 минут ұстаңыз; A буфері 5% ACN және 10 мМ аммоний бикарбонатынан (ABC), ал B буфері 80% ACN және 10 мМ ABC құрайды. Әр 3 минут сайын фракцияларды жинап, оларды екі топқа (1 + 17, 2 + 18 және т.б.) біріктіріп, вакуумдық центрифугада кептіріңіз.
LC-MS/MS талдауы. Масс-спектрометрия үшін пептидтер (r119.aq нөмірі) 1,9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQ ортасымен (Dr. Maisch, mat) жабдықталған 25 см, 75 мкм ішкі диаметрлі PicoFrit аналитикалық бағанында (жаңа объектив линзасы, бөлшек нөмірі PF7508250) бөлінді, Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германия). Баған 50°C температурада ұсталды. A және B буферлері судағы 0,1% құмырсқа қышқылынан және 80% ACN-дегі 0,1% құмырсқа қышқылынан тұрады. Пептидтер 6%-дан 31%-ға дейінгі B буферінен 65 минутқа және 31%-дан 50%-ға дейінгі B буферінен 5 минутқа 200 нл/мин градиентімен бөлінді. Элюцияланған пептидтер Orbitrap Fusion масс-спектрометрінде (Thermo Fisher Scientific) талданды. Пептид прекурсорының m/z өлшеуі 350-ден 1500 м/з диапазонында 120 000 ажыратымдылықпен орындалады. 27% нормаланған соқтығысу энергиясын пайдаланып, жоғары энергиялы C тұзақ диссоциациясы (HCD) бөлінуі үшін 2-ден 6-ға дейінгі заряд күйі бар ең күшті прекурсор таңдалады. Цикл уақыты 1 с-қа орнатылды. Пептид фрагментінің m/z мәні ион тұзағында ең кіші AGC нысанасы 5×104 және максималды инъекция уақыты 86 мс арқылы өлшенді. Фрагментациядан кейін прекурсор 45 с бойы динамикалық алып тастау тізіміне енгізілді. TMT-белгіленген пептидтер 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap бағанында (Thermo Fisher Scientific, каталог нөмірі 164942) бөлінді, ал миграция спектрлері жоғары өрісті асимметриялық толқын пішінді иондармен (FAIMS) жабдықталған Orbitrap Lumos Tribrid масс-спектрометрінде (Thermo Fisher Scientific) талданды (Thermo Fisher Scientific), ол −50 және −70 В екі компенсациялық кернеуде жұмыс істейді. TMT есебінің иондық сигналын өлшеу үшін синхрондау прекурсорына негізделген таңдалған MS3 қолданылады. Пептидті бөлу EASY-nLC 1200 құрылғысында 90% сызықтық градиент элюциясын пайдаланып, буфер концентрациясы 6%-дан 31%-ға дейін, ал A буфері 0,1% FA, ал B буфері 0,1% FA және 80% ACN болды. Аналитикалық баған 50°C температурада жұмыс істейді. Бастапқы файлды FAIMS компенсациялық кернеуіне сәйкес бөлу үшін FreeStyle (1.6 нұсқасы, Thermo Fisher Scientific) пайдаланыңыз.
Ақуызды анықтау және сандық бағалау. Кіріктірілген Andromeda іздеу жүйесін пайдаланып, бастапқы деректер MaxQuant 1.5.2.8 нұсқасын (https://maxquant.org/) пайдаланып талданды. Aequorea victoria-дан алынған Cre рекомбиназасы мен YFP тізбектерінен басқа, тышқанның анықтамалық протеомының (Proteome ID UP000000589, UniProt-тан 2017 жылдың мамыр айында жүктелген) канондық тізбегі мен изоформалық тізбегі үшін пептид фрагментінің спектрлері ізделді. Метиониннің тотығуы және ақуыздың N-терминалды ацетилденуі айнымалы модификациялар ретінде белгіленді; цистеин карбамойлының метилденуі бекітілген модификациялар ретінде белгіленді. Ас қорыту параметрлері «ерекшелік» және «трипсин/P» мәндеріне орнатылған. Ақуызды анықтау үшін қолданылатын пептидтер мен ұстара пептидтерінің ең аз саны - 1; бірегей пептидтердің ең аз саны - 0. Пептид картасын сәйкестендіру жағдайында ақуызды анықтау жылдамдығы 0,01 болды. «Екінші пептид» опциясы қосылған. Әртүрлі түпнұсқа файлдар арасында сәтті идентификацияларды тасымалдау үшін «іске қосулар арасындағы сәйкестендіру» опциясын пайдаланыңыз. Белгісіз сандық бағалау (LFQ) үшін LFQ минималды коэффициентінің 1 санын пайдаланыңыз (60). LFQ қарқындылығы әр уақыт нүктесінде кем дегенде бір генотип тобында кем дегенде екі жарамды мән үшін сүзіледі және ені 0,3 және төмен қарай 1,8 болатын қалыпты үлестірімнен экстраполяцияланады. LFQ нәтижелерін талдау үшін Perseus есептеу платформасын (https://maxquant.net/perseus/) және R (https://r-project.org/) пайдаланыңыз. Дифференциалды экспрессияны талдау үшін limma бағдарламалық жасақтама пакетінен екі жақты орташа t сынағы пайдаланылды (61). Зерттеу деректерін талдау ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally және pheatmap көмегімен орындалады. TMT негізіндегі протеомика деректері MaxQuant 1.6.10.43 нұсқасын пайдаланып талданды. 2018 жылдың қыркүйегінде жүктелген UniProt адам протеомикасы дерекқорынан шикі протеомика деректерін іздеңіз. Талдауға өндіруші ұсынған изотоп тазалығын түзету коэффициенті кіреді. Дифференциалды экспрессияны талдау үшін R тіліндегі limma пайдаланыңыз. Бастапқы деректер, дерекқорды іздеу нәтижелері және деректерді талдау жұмыс процесі мен нәтижелерінің барлығы PXD019690 деректер жиынтығы идентификаторымен PRIDE серіктес репозиторийі арқылы ProteomeXchange альянсында сақталады.
Функционалдық аннотациялар талдауды байытады. 8 аптадағы деректер жиынтығының функционалды аннотация терминдерінің байлығын анықтау үшін Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) құралы пайдаланылды (1-сурет). Қысқаша айтқанда, LC-MS/MS (тандемдік масс-спектрометрия) деректерін талдаудан алынған сандық ақуыз тізімі келесі сүзгі критерийлерімен қолданылады: Mus musculus түр және фон ретінде таңдалады, ал санат Benjaminini арқылы 0,05 немесе одан төмен байыту үшін түзетілген P мәні маңызды болып саналады. Бұл график үшін әр кластердегі түзетілген P мәніне негізделген ең жақсы бес артық санат көрсетілген. Benjaminini, Krieger және Yekutieli (Q = 5%) екі сатылы сызықтық күшейту бағдарламасын пайдалана отырып, бірнеше t-тестін қолдана отырып, әр санатта анықталған маңызды кандидаттар бойынша уақыттық процестік ақуыз экспрессиясын талдау жүргізіледі және әр жол бөлек талданады. Бірізді SD қабылдаудың қажеті жоқ.
Осы зерттеудің нәтижелерін жарияланған дерекқорлармен салыстыру және 1-суретте Венн диаграммасын жасау үшін біз сандық ақуыз тізімін MitoCarta 2.0 аннотацияларымен біріктірдік (24). Диаграмманы жасау үшін Draw Venn Diagram онлайн құралын (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) пайдаланыңыз.
Протеомика талдауы үшін қолданылатын статистикалық процедуралар туралы толық ақпарат алу үшін «Материалдар мен әдістер» бөлімінің тиісті бөлімін қараңыз. Барлық басқа тәжірибелер үшін толық ақпаратты тиісті аңыздан табуға болады. Басқаша көрсетілмесе, барлық деректер орташа ± SEM ретінде көрсетілген және барлық статистикалық талдаулар GraphPad Prism 8.1.2 бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып жүргізілді.
Осы мақалаға қосымша материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 сайтынан қараңыз.
Бұл Creative Commons Attribution-Non-Commercial лицензиясының шарттары бойынша таратылатын ашық қолжетімді мақала, ол кез келген құралда пайдалануға, таратуға және көбейтуге мүмкіндік береді, егер соңғы пайдалану коммерциялық пайда табу үшін болмаса және түпнұсқа жұмыс дұрыс болса. Сілтеме.
Ескертпе: Біз сізден тек электрондық пошта мекенжайыңызды беруіңізді сұраймыз, сонда сіз парақшаға ұсынған адам сіздің электрондық поштаны көруін қалайтыныңызды және оның спам емес екенін білуі керек. Біз ешқандай электрондық пошта мекенжайларын тіркемейміз.
Бұл сұрақ сіздің келуші екеніңізді тексеру және спамның автоматты түрде жіберілуін болдырмау үшін қолданылады.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМ.В.Кочан, К.Фольц-Донаху, В.Сактивелу, П.Джавалиско, Н.Тони, Дж.Пуяль, ​​Н.-Г. Ларсон
Дисфункционалды нейрондардың протеомикасын талдау метаболикалық бағдарламалардың нейродегенерацияға қарсы тұру үшін белсендірілетінін көрсетті.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМ.В.Кочан, К.Фольц-Донаху, В.Сактивелу, П.Джавалиско, Н.Тони, Дж.Пуяль, ​​Н.-Г. Ларсон
Дисфункционалды нейрондардың протеомикасын талдау метаболикалық бағдарламалардың нейродегенерацияға қарсы тұру үшін белсендірілетінін көрсетті.
©2020 Америка ғылымды дамыту қауымдастығы. барлық құқықтар қорғалған. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef және COUNTER серіктесі болып табылады. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.