Қазіргі мекенжайы: OX11 0DE, Ұлыбритания, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Оксфордшир, Ұлыбритания, Diamond Light Source Co., Ltd., Электрондық биологиялық бейнелеу орталығы.
Реакция орталығының жарық жинау кешені 1 (RC-LH1) күлгін фототрофты бактериялардың негізгі фотосинтетикалық компоненті болып табылады. Біз Rhodopseudomonas palustris-тен алынған RC-LH1 кешенінің екі криоэлектронды микроскопиялық құрылымын енгіздік. RC-LH114-W кешенінің 2,65-Å ажыратымдылықтағы құрылымы RC-ді қоршап тұрған 14 LH1 суббірлігінен тұрады, ол W ақуызымен үзіледі, ал W ақуызы жоқ кешен толығымен RC құрамымен қоршалған. LH1 ілмегінің 16 суббірлігін жабық. Бұл құрылымдарды салыстыру RC-LH1 кешеніндегі хинонның динамикасы туралы, соның ішінде RC QB орнында хинонмен байланысқан кезде бұрын анықталмаған конформациялық өзгерістер, сондай-ақ оларды RC-ге өткізуге көмектесетін көмекші хинон байланыс орындарының орналасуы туралы түсінік береді. W ақуызының ерекше құрылымы LH1 ілмегінің жабылуына жол бермейді, осылайша хинон/хинолон алмасуын жеделдету үшін арна жасайды.
Фотосинтезбен қамтамасыз етілетін энергия жер бетіндегі барлық дерлік тіршілікті қамтамасыз ете алады және күн биотехнологиясы үшін үлкен әлеуетке ие. Күлгін фототрофты бактериялар жаһандық фотосинтезді ілгерілетумен қатар, әртүрлі энергия режимдері мен метаболикалық мүмкіндіктерді де көрсетеді. Олар фотосинтезден аулақ болып, қараңғыда гетеротрофты бактериялар ретінде өсе алады, азот пен көмірқышқыл газын бекіте алады, сутегін өндіре алады және хош иісті қосылыстарды ыдырата алады (1-3). Бұл процестер үшін энергия беру үшін жарық тез және тиімді түрде химиялық энергияға айналуы керек. Бұл процесс жарықты ұстайтын антенна кешені жарықты сіңіріп, ұсталған энергияны реакция орталығына (RC) берген кезде басталады, осылайша зарядтың бөлінуі басталады (4-7). Күлгін фототрофты бактериялардағы фотосинтездің негізгі бірлігі RC-LH1 негізгі кешенін құрайтын жарық жинайтын 1 кешенімен (LH1) қоршалған 2 типті RC-ден тұрады. LH1 әрқайсысы екі бактериялық хлорофилл (BChl) a молекуласымен және бір немесе екі каротиноидпен (8-12) байланысатын қисық αβ гетеродимерлерінің массивінен түзіледі. Ең қарапайым LH1 антеннасы RC (9-13)-ті тұйық циклде қоршап тұрған 16 немесе 17 αβ гетеродимерлерден тұрады, бірақ басқа негізгі кешендерінде трансмембраналық пептидтер қоршаған LH1-дің үздіксіздігін бұзады, осылайша RC мен цитохром bc1 кешені арасындағы хинол/хинон диффузиясын күшейтеді (11, 13-15). Күлгін фототрофты өсімдік Rhodopseudomonas (Rps.) - фотосинтезді қолдайтын энергия мен электрон алмасуын түсіне алатын модельдік организм. Rps-тің алғашқы кристалдық құрылымы. Palustris RC-LH1 кешенінің моделі - RC, ол 15 гетеродимерлік LH1 ілмектерімен қоршалған, олар «Protein W» деп аталатын белгісіз ақуызбен үзілген (14). Кейіннен Protein-W RPA4402 ретінде анықталды, ол үш болжамды трансмембраналық спиральдары (TMH) бар сипатталмаған 10,5 кДа ақуыз (16). Біз W ақуызын кодтайтын rpa4402 генін RC-L, M (pufL, pufM) және LH1α, β (pufA, pufB) суббірліктерін кодтайтын гендер үшін қолданылатын номенклатураға сәйкес келу үшін pufW деп атауды ұсынамыз. Қызығы, W ақуызы RC-LH1-дің шамамен 10%-ында ғана болады, бұл Rps. palustris екі түрлі RC-LH1 кешендерін шығаратынын көрсетеді. Мұнда біз екі негізгі кешеннің жоғары ажыратымдылықтағы крио-ЭМ (крио-ЭМ) құрылымдарын ұсынамыз, біреуі W ақуызы және 14 αβ гетеродимерлері бар, екіншісі W ақуызы жоқ және жабық 16 гетеродимер LH1 ілмегі бар. Біздің құрылымымыз Rps. palustris-тің RC-LH1 кешенін түсінудегі сатылы өзгерісті білдіреді, себебі біз әрбір нұсқаның біртекті популяциясын талдадық және әрбір пептидті және байланысқан пигменттерді және онымен байланысты липидтер мен хинондарды анық тағайындау үшін жеткілікті ажыратымдылыққа ие болдық. Бұл құрылымдарды салыстыру басқа RC-LH1 кешенінде табылмаған үш TMH ақуызы-W хинон/хинолон алмасуын жеделдету үшін хинон арнасын жасайтынын көрсетеді. Бірқатар сақталған липидтер мен хинон байланысу орындары анықталды, және біз хинон мен RC комбинациясынан кейін жаңа конформациялық өзгерісті анықтадық, бұл оттегімен қаныққан фототрофты организмдердің II фотожүйесінің (PSII) RC-іне қолайлы болуы мүмкін. Біздің зерттеу нәтижелеріміз күлгін фототрофты бактериялардың RC-LH1 негізгі кешеніндегі хинон/хинолон байланысуы мен алмасуының кинетикасы туралы жаңа түсініктер береді.
Rps. palustris-те табылған екі кешенді егжей-тегжейлі зерттеуді жеңілдету үшін біз әрбір RC-LH1-ді биохимиялық әдістермен бөліп алдық. Ақуыз W-жеткіліксіз кешені (бұдан әрі ΔpufW деп аталады) pufW гені жоқ штаммнан тазартылды (16), және тек бір RC-LH1 кешенін алуға болады. Ақуыз W-құрамдас кешен штамммен өндіріледі. Бұл штаммның W ақуызы C-терминалында 10x His тегімен модификацияланған, сондықтан ақуыз W-құрамдас кешен металлды иммобилизациялау арқылы көптеген жетіспейтін W ақуызымен тиімді түрде біріктірілуі мүмкін. Кешен тиімді түрде бөлінеді (16) Аффиндік хроматография (IMAC).
1-суретте көрсетілгендей, екі кешенде де LH1 антеннасымен қоршалған үш қосалқы RC (RC-L, RC-M және RC-H) бар. Ақуыз-W жоқ кешеннің 2.80-A құрылымында RC-ді толығымен қоршап тұрған тұйық LH1 ілмегі түзілетін 16 αβ гетеродимерлері бар, ол бұдан әрі RC-LH116 кешені деп аталады. Ақуыз-W бар кешеннің 2.65Å құрылымында ақуыз-W үзілген 14-гетеродимер LH1 бар, ол бұдан әрі RC-LH114-W деп аталады.
(A және B) Қосылыстың беттік көрінісі. (C және D) Таяқшаларда көрсетілген байланысқан пигменттер. (E және F) Цитоплазмалық беттен байқалатын кешендер мультфильмдерде көрсетілген пептидтер мен LH1 суббірліктеріне ие және ақуыз-W саңылауларынан сағат тілімен нөмірленген [Rba нөмірлеуіне сәйкес келеді. сфероидтер кешені (13)]. LH1-α үшін ақуыз суббірлігінің түсі сары; LH1-β үшін ақуыз суббірлігінің түсі көк; ақуыз-W үшін ақуыз қызыл; RC-H үшін көгілдір; RC-L үшін қызғылт сары; RC-M үшін қызыл күрең. Кофакторлар таяқшалармен, жасыл BChl және BPh a молекулаларын, күлгін каротиноидтарды, ал сары UQ10 молекулаларын білдіреді. (G және H) RC-LH114-W кешенінің (G) және RC-LH116 кешенінің (H) эквивалентті аймағындағы ақуыз-W саңылауының үлкейтілген көрінісі. Кофакторлар кеңістікті толтыру түрінде көрсетіледі, хелатталған хинон көк түспен көрсетіледі. Ақуыз-W саңылауы (G) ішінде көк түсті үзік сызықпен, ал хинон/хинолол LH116 сақинасында диффузияланатын кішкентай тесіктер (H) ішінде қара үзік сызықпен белгіленген.
1-суретте (A және B) әрқайсысы екі BChl және бір каротиноидпен байланысатын LH1αβ гетеродимерлерінің ашық немесе жабық массивтерімен қоршалған RC көрсетілген (1, C және D суреттері). Алдыңғы зерттеулер Rps - LH1 кешені екенін көрсетті. Спирулина ксантинінің биосинтетикалық жолында бұл түрлерде каротиноидтардың аралас популяциялары бар (17). Дегенмен, спиропирроксантин доминантты каротиноид болып табылады және оның тығыздығы қанағаттанарлық. Сондықтан біз спироксантинді барлық LH1 байланысатын орындарда модельдеуді таңдадық. Альфа және бета полипептидтері - қысқа мембраналық сыртқы аймақтары бар жалғыз TMH (1, A, B, E және F суреттері). С-терминалында 17 қалдықтың тығыздығы байқалмаса да, альфа полипептиді екі кешенде де Met1-ден Ala46-ға дейін бөлінді. RC-LH116-да β полипептиді Gly4-тен Tyr52-ге дейін, ал RC-LH114-W-да Ser5-тен Tyr52-ге дейін тотықсызданды. 3 немесе 4 N-терминалды немесе 13 C-терминалды қалдықтардың тығыздығы байқалмады (S1 сурет). Жабайы типті штаммнан дайындалған аралас RC-LH1 кешенінің масс-спектрометриялық талдауы жоғалған аймақтың осы пептидтердің гетерологиялық бөлінуінің нәтижесі екенін көрсетті (S1 және S2 суреттер). α-Met1-дің N-терминалды формилденуі де байқалды (f). Талдау α-пептидтің fMet1-ден Asp42/Ala46/Ala47/Ala50-ге дейінгі қалдықтардан, ал β-пептидтің Ser2-ден Ala53-ке дейінгі қалдықтардан тұратынын көрсетті, бұл төмен температуралы ЭМ тығыздық картасымен жақсы сәйкес келеді.
α-His29 және β-His36 координациясы BChls-ті бетпе-бет етеді; әрбір αβ гетеродимері көршілерімен бірігіп, RC экситонмен байланысқан пигмент массивінің айналасында ашық цикл (RC-LH114-W) немесе тұйық цикл (RC-LH116) түзеді (1-сурет, C және D). RC-LH114-W-ның 877 нм жолағымен салыстырғанда, RC-LH116-ның 880 нм жұтылу қызыл ығысуы 3 нм құрайды (2A-сурет). Дегенмен, дөңгелек дихроизм спектрі бірдей дерлік (2B-сурет), бұл ашық және тұйық циклдар арасында айқын айырмашылық болғанымен, BChls жергілікті ортасы өте ұқсас екенін көрсетеді. Жұтылу қызыл ығысуы тұйық циклдегі жылу қозғалысының төмендеуі мен тұрақтылықтың жоғарылауының (18, 19), тұйық циклден туындаған пигмент байланысының өзгеруінің (20, 21) немесе осы екі әсердің тіркесімінің (11) нәтижесі болуы мүмкін.
(A) Ультракүлгін/көрінетін/жақын инфрақызыл жұтылу спектрі, оның шыңдары сәйкес пигменттерімен белгіленіп, 775 нм-дегі BPh шыңына дейін қалыпқа келтірілген. (B) 805 нм-дегі BChl жұтылу деңгейіне дейін қалыпқа келтірілген дөңгелек дихроизм спектрі. (C және D) RC-LH114-W кешенінің (C) және RC-LH116 кешенінің (D) уақыт бойынша шешілген жұтылу спектрлерінен таңдалған ΔA спектрлері. Жақсы салыстыру үшін барлық спектрлер 0,2 пс-те −A-ның ∆A-ға дейін қалыпқа келтірілген. (E) UQ2 әртүрлі концентрациялары болған кезде сәулеленуден кейінгі цитохром c2 тотығу жылдамдығы (шикі деректер үшін S8 суретін қараңыз). (F) Төмен, орташа немесе жоғары қарқынды жарықта (сәйкесінше 10, 30 немесе 300μMm-2 s-1) өсірілген жасушаларда тазартылған кешендегі W ақуызының және RC-L суббірліктерінің және бөлінген мембрана қатынасының. Ақуыз деңгейін SDS-полиакриламид гель электрофорезі және иммуноанализ арқылы анықтаңыз (шикі деректер үшін S9 суретін қараңыз). Тазартылған RC-LH114-W кешеніне қатысты қатынасын анықтаңыз. Кешеннің RC-L және ақуыз-W стехиометриялық қатынасы 1:1 құрайды.
RC-LH114-W деформацияланған αβ14 ілмегіндегі 1-ші позициядағы BChls (1-сурет, A, C және E) RC-LH116-дағы эквивалентті BChls-ке қарағанда RC бастапқы донорына (P) 6,8Å-ге жақын (1-сурет, B, D және F, және S3-сурет); дегенмен, екі кешеннің өтпелі жұтылу кинетикасы RC-LH114-W және RC-LH116 үшін LH1-ден RC-ге қоздыру энергиясын беру уақытының тұрақтылары 40 ±4 және 44±3 ps екенін көрсетеді (2-сурет). , C және D, S4-сурет және S2-кесте). RC ішіндегі электрондық беруде де айтарлықтай айырмашылық жоқ (S5-сурет және онымен байланысты қосымша мәтін). LH1 және RC-P арасындағы энергия беру уақытының жақын сәйкестігі екі LH1 ілмегіндегі көптеген BChl-дің қашықтығының, бұрышының және потенциалдық энергиясының ұқсастығына байланысты деп болжаймыз. LH1 энергия үлгісін зерттеу минималды қашықтыққа жету үшін энергияны субоптималды орындардан RC-ге тікелей беруден жылдам емес сияқты. RC-LH114-W ішіндегі ашық циклді LH1 ілмегі құрылымдық талдау үшін төмен температура жағдайында елеусіз жылулық қозғалысқа ұшырауы мүмкін және бөлме температурасында RC 1 позициясындағы βBChls пигментация қашықтығынан ұзағырақ αβ14 сақина конформациясы бар.
RC-LH116 кешенінде 32 BChl және 16 каротиноид бар, және оның жалпы орналасуы Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 штаммынан (PDB ID 7C9R) (12) және жасыл балдырлардан (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) алынған орналасумен бірдей. Тегістеуден кейін αβ гетеродимерлерінің орналасуында, әсіресе 1-5, 15 және 16-да, тек шағын ауытқулар байқалды (S6 сурет). Ақуыз-W болуы LH1 құрылымына айтарлықтай әсер етеді. Оның үш TMH қысқа ілмектермен байланысқан, N-терминалы кешеннің люмен жағында, ал C-терминалы цитоплазмалық жағында орналасқан (1A және 3 суреттер, A-дан D-ге дейін). Ақуыз-W негізінен гидрофобты (3B сурет), ал TMH2 және TMH3 LH1αβ-14-пен әрекеттесіп, трансмембраналық бет түзеді (3-сурет, B және E-ден G-ге дейін). Интерфейс негізінен трансмембраналық аймақтағы Phe, Leu және Val қалдықтарынан тұрады. Бұл қалдықтар гидрофобты аминқышқылдарымен және αβ-14 пигменттерімен қабаттасқан. Кейбір полярлық қалдықтар да өзара әрекеттесуге ықпал етеді, соның ішінде кешен қуысының бетіндегі W-Thr68 мен β-Trp42 арасындағы сутектік байланыс (3-сурет, F және G). Цитоплазманың бетінде Gln34 αβ-14 каротиноидтарының кето тобына жақын орналасқан. Сонымен қатар, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекуласы бөлінді, ал оның гидрофобты құйрығы ақуыз-W мен αβ-14 арасындағы интерфейске дейін созылды, ал липидтік құйрық денеде орналасуы мүмкін. Сондай-ақ, W ақуызы мен RCH ақуызының С-терминалды ажыратымдылық аймақтары өте жақын екенін, бірақ нақты өзара әрекеттесулерді қалыптастыру шеңберінде емес екенін байқадық (1-сурет, A және E). Дегенмен, осы екі ақуыздың шешілмеген С-терминалды аминқышқылдарында өзара әрекеттесулер болуы мүмкін, бұл RC-LH114-W кешенін құрастыру кезінде ақуыз-W-ны тарту механизмін қамтамасыз етуі мүмкін.
(A) LH1αβ14-пен мультфильм түрінде шекараласатын Protein-W электростатикалық потенциал диаграммасының бір бөлігінде көрсетілген таяқша тәрізді бүйір тізбегіне (қызыл) ие (контур деңгейі 0,13 болатын мөлдір сұр бет). (B) Protein-W гидрофобты түсті бетпен көрсетілген. Полярлық және зарядталған аймақтар көгілдір түспен, гидрофобты аймақтар ақ түспен, ал қатты гидрофобты аймақтар қызғылт сары түспен көрсетілген. (C және D) Protein-W мультфильмде көрсетілген, оның бағыты (A) (C)-дегідей және 180°-қа бұрылған (D). Тізбектегі позицияға сәйкес, ажыратылатын қалдықтар кемпірқосақ түс схемасын қабылдайды, мұнда N-ұштығы көк, ал С-ұштығы қызыл. (E) Protein-W (A)-дағыдай көріністе және Protein-W:LH1 шекарасындағы қалдықтар бекітілген белгілері бар таяқшалармен көрсетілген. (F) Ақуыз-W мультфильм көрінісінде (E) және LH1αβ14-ке қатысты 90°-қа, ал жолақ көрінісінде интерфейс қалдықтарына қатысты бұрылған. Бета-полипептидтен шыққан ілулі қалдықтар белгіленген. Кофактор 1-суреттегі түске сәйкес келетін жолақ ретінде көрсетілген, ыдыраған β-DDM сұр түспен, ал оттегі қызыл түспен көрсетілген. (G) (F) көрініс 180°-қа бұрылған, белгіленген альфа-полипептидтің көрінетін қалдықтары бар.
Protein-W αβ гетеродимерін (1F суреттегі 15-ші) ауыстырады, осылайша ілмектің жабылуына және алғашқы үш αβ гетеродимерінің еңкейуіне жол бермейді. Бірінші αβ-1 гетеродимерінің пленка нормасына қатысты максималды еңкейу бұрышы 25°-тан 29°-қа дейін екені байқалды (1-сурет, A және E), бұл RC A өткір контраст-LH116-да αβ-1-дің 2°-тан 8°-қа дейін еңкейуінен пайда болды (1-сурет, B және F). Екінші және үшінші гетеродимерлер сәйкесінше 12°-тан 22°-қа дейін және 5°-тан 10°-қа дейін еңкейеді. RC-нің стерикалық кедергісіне байланысты αβ-1 еңкейуі αβ-тың екінші жұбын қамтымайды (ол 1F суреттегі 16-шы αβ-қа сәйкес келеді), осылайша LH1 сақинасында айқын саңылау түзеді (1-сурет, A және E). Екі αβ гетеродимерінің болмауына, төрт BChl және екі каротиноидтың жоғалуына байланысты, каротиноидтардың ешқайсысы бұралған αβ-1 суббірлігіне байланыспайды, нәтижесінде 13 Vegetarian және 28 BChl каротиноидтары бар LH114-W сақинасы пайда болады. αβ1-ден 7-ге дейінгі аймақтардағы екі кешеннің жергілікті ажыратымдылық бағалары LH1 циклінің қалған бөлігіне қарағанда төмен, бұл RC QB сайтына іргелес орналасқан LH1 суббірлігінің ішкі пластикасын көрсетуі мүмкін (4-сурет).
RC-LH114-W (A және B) және RC-LH116 (C және D) суреттері 1-суреттегі (B және D) бірдей жоғарғы көріністен/бүйірден (A және B) (A және C) және қуыс бетінен көрсетілген. Түрлі-түсті пернелер оң жақта көрсетілген.
Стехиометриялық қатынасы 1:14 болатын жалғыз тән ядролық кешен - Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димері (13). Дегенмен, W және PufX ақуыздарының айқын гомологиясы жоқ және олардың тиісті LH1 құрылымдарына айтарлықтай әсер етеді. PufX - бұл RC-H суббірлігінің (13) цитоплазмалық жағымен Rps. palustris LH116αβ-16 сәйкес келетін жерде әрекеттесетін N-терминалды цитоплазмалық домені бар жалғыз TMH. PufX RC-LH1 мен цитохром bcl кешені арасындағы хинон/хинолон алмасуы үшін арна жасайды және барлық Rba. sphaeroides ядролық кешенінде болады (13). Мономер-мономер интерфейсі Rba-да болса да. RC-LH1-PufX димері сфероидтары RC-LH114-W-дағы W ақуызының байланысу орнында орналасқан, ал PufX пен W ақуызымен индукцияланған саңылау эквивалентті орында орналасқан (S7A сурет). RC-LH114-W-дағы саңылау сонымен қатар W немесе PufX ақуызымен байланысты емес пептидтерден түзілген Pseudomonas rosea LH1 гипотетикалық хинон каналымен (8) тураланған (S7B сурет). Сонымен қатар, Blc-дағы хинон каналы. Бір γ суббірлігін (7) алып тастау арқылы түзілген изумруд жасыл LH1 ұқсас орында орналасқан (S7C сурет). Әртүрлі ақуыздар арқылы жүзеге асырылғанымен, бұл хинон/хинолол каналдарының RC-LH1 кешенінде ортақ орында пайда болуы конвергентті эволюцияның мысалы болып көрінеді, бұл W ақуызы жасаған саңылау хинон каналы ретінде әрекет етуі мүмкін екенін көрсетеді.
LH114-W ілмегіндегі саңылау ақуыздардағыдай ақуыз тесігі арқылы екі доменді байланыстырудың орнына, RC-LH114-W кешені мен негізгі мембрана арасындағы үздіксіз мембрана аймағының пайда болуына мүмкіндік береді (1G-сурет). RC-LH116 кешені жабық Tch. Ине тәрізді кешенге ұқсас (22) (1H-сурет). Хинонның мембрана арқылы диффузиясы тар ақуыз арнасы арқылы диффузияға қарағанда жылдамырақ болғандықтан, ашық LH114-W ілмегі жабық LH116 ілмегіне қарағанда RC айналымын жылдамдатуға мүмкіндік береді, ал хинонның RC-ге диффузиясы шектеулі болуы мүмкін. W ақуызының RC арқылы хинондардың конверсиясына әсер ететінін тексеру үшін біз убихинон 2 (UQ2) белгілі бір концентрациясында (изопрен құйрығы қысқа табиғи UQ10 аналогы) цитохромды тотығу анализін жүргіздік (2E-сурет). Хелатталған хинонның болуы Михаэлис тұрақтысын дәл анықтауға кедергі келтірсе де (RC-LH114-W және RC-LH116 сәйкесінше 0,2±0,1μM және 0,5±0,2μM үшін жарамды), RC-LH114-W максималды жылдамдығы (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116-дан (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) 28±5%-ға жоғары.
Бастапқыда біз ақуыз-W негізгі кешеннің шамамен 10%-ында бар деп есептедік (16); мұнда жарық аз, орташа жарық және жарық көп түсетін өсу жасушаларының толтырылу деңгейі сәйкесінше 15±0,6%, 11±1% және 0,9±0,5% құрайды (2F сурет). Масс-спектрометрияны сандық салыстыру гистидин тегінің қосылуы жабайы типті штамдармен салыстырғанда ақуыз-W салыстырмалы мөлшерін төмендетпегенін көрсетті (P = 0,59), сондықтан бұл деңгейлер модификацияланған ақуыз-W артефакті емес (S10 сурет). Дегенмен, RC-LH1 кешеніндегі ақуыз-W-ның бұл төмен толтырылуы кейбір RC-лердің жеделдетілген жылдамдықпен айналуына мүмкіндік береді, осылайша RC-LH116 кешеніндегі хинон/хинолон алмасуының баяулауын азайтады. Біз жарықтың жоғары толтырылу деңгейі соңғы транскриптомика деректерімен сәйкес келмейтінін байқадық, бұл pufW генінің экспрессиясының күшті жарық кезінде артатынын көрсетеді (S11 сурет) (23). pufW транскрипциясы мен ақуыз-W-ның RC-LH1 кешеніне қосылуы арасындағы айырмашылық шатастырады және ақуыздың күрделі реттелуін көрсетуі мүмкін.
RC-LH114-W-да 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерин (POPG) және 29 β-DDM молекулалары бөлінген және модельденген: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG және 12 βDDM. RC-LH116 (5-сурет, A және B). Бұл екі құрылымда CDL кешеннің цитоплазмалық жағында орналасқан, ал POPC, POPG және β-DDM көбінесе люменальды жағында орналасқан. RC-LH114-W кешенінің αβ-1-ден αβ-6-ға дейінгі аймағында екі липидті және жуғыш зат молекулалары бөлініп алынған (5A-сурет), ал бесеуі RC-LH116 эквивалентті аймағында бөлінген (5B-сурет). Кешеннің екінші жағында, негізінен CDL, RC мен αβ-7-ден αβ-13-ке дейін жиналған көбірек липидтер табылды (5-сурет, A және B). Басқа құрылымдық түрде шешілген липидтер мен жуғыш заттар LH1 сақинасының сыртында орналасқан, ал жақсы шешілген ацил тізбектері LH1 суббірліктері арасында созылады, RC-LH114-W-да шартты түрде β-DDM ретінде белгіленеді және β-DDM мен POPC-LH116 қоспасының RC A қоспасында β-DDM ретінде анықталады. Біздің құрылымымыздағы хелаттаушы липидтер мен жуғыш заттардың ұқсас орналасуы олардың физиологиялық тұрғыдан маңызды байланыс орындары екенін көрсетеді (S12A сурет). Tch-тегі эквивалентті молекулалардың орналасуы да жақсы консистенцияға ие. Gentle және Trv. 970 RC-LH1s штаммы (S12 сурет, B-ден E-ге дейінгі) (9, 12) және липидті бас тобының сутектік байланыс қалдықтары тізбектің туралануында жақсы сақталуын көрсетті (S13 сурет), бұл RC-мен байланысатын сақталған CDL (24), бұл учаскелер RC-LH1 кешенінде сақталуы мүмкін екенін көрсетеді.
(A және B) RC-LH114-W (A) және RC-LH116 (B) пептидтері мультфильмдермен, ал пигменттер таяқшалармен 1-суреттегі түс схемасын пайдаланып көрсетілген. Липидтер қызыл түспен, ал жуғыш заттар сұр түспен көрсетілген. RC QA және QB учаскелерімен байланысқан UQ сары, ал оқшауланған UQ көк түсті. (C және D) (A) және (B) сияқты көріністер, липидтер алынып тасталған. (E-ден G-ге дейін) RC-LH116-дан алынған Q1(E), Q2(F) және Q3(G) үлкейтілген көрінісі, бір-біріне әсер ететін бүйір тізбектері бар. Сутектік байланыстар қара үзік сызықтармен көрсетілген.
RC-LH116-да зарядты бөлу процесінде электрон тасымалына қатысатын RC QA және QB UQ екеуі де байланыс орындарында ыдырайды. Дегенмен, RC-LH114-W-да QB хиноны шешілмеген және төменде егжей-тегжейлі талқыланады. QA және QB хинондарынан басқа, RC-LH114-W құрылымында екі хелатталған UQ молекуласы (RC және LH1 сақиналары арасында орналасқан) олардың жақсы шешілген бас топтарына сәйкес (сәйкесінше Q1 және Q2-де орналасқан) бөлінген. кеңістік). 5C сурет). Q1-ге екі изопрен бірлігі тағайындалған, ал тығыздық картасы Q2-нің толық 10 изопрен құйрығын анықтайды. RC-LH116 құрылымында үш хелатталған UQ10 молекуласы (Q1-ден Q3-ке дейін, 5D сурет) шешілген, және барлық молекулалардың құйрық бойында айқын тығыздығы бар (5-сурет, D-ден G-ге дейін). Екі құрылымда Q1 және Q2 хинон бас топтарының орналасуы тамаша консистенцияға ие (S12F суреті) және олар тек RC-мен әрекеттеседі. Q1 RC-LH114-W W саңылауының кіреберісінде орналасқан (1G және 5 суреттер, C, D және E суреттері), ал Q2 QB байланысу орнына жақын орналасқан (5 сурет, C, D) және F). Сақталған L-Trp143 және L-Trp269 қалдықтары Q1 және Q2-ге өте жақын және әлеуетті π-қабаттасу өзара әрекеттесулерін қамтамасыз етеді (5 сурет, E және F суреттері және S12 суреті). Q1 дистальды оттегінен 3,0 Å алынған L-Gln88 күшті сутектік байланысты қамтамасыз етеді (5E суреті); бұл қалдық ең алыс байланыстан басқа барлық RC-лерде сақталған (S13 суреті). L-Ser91 басқа RC-лердің көпшілігінде Thr орнына консервативті түрде ауыстырылады (S13 сурет), Q1 метил оттегісінен 3,8 ангстремді құрайды және әлсіз сутектік байланыстарды қамтамасыз етуі мүмкін (5E сурет). Q3 белгілі бір өзара әрекеттесуге ие емес сияқты, бірақ RC-M суббірлігі мен LH1-α 5-тен 6-ға дейінгі суббірлігі арасындағы гидрофобты аймақта орналасқан (5 сурет, D және G). Q1, Q2 және Q3 немесе жақын жердегі хелатталған хинондар Tch. Gentle, Trv. Strain 970 және Blc-де де ажыратылған. Ирис құрылымы (9, 10, 12) RC-LH1 кешеніндегі сақталған көмекші хинон байланыс орнын көрсетеді (S12G сурет). RC-LH116 құрамындағы бес ыдыраған UQ жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясы (HPLC) арқылы анықталған әрбір кешеннің 5,8±0,7 мәнімен жақсы сәйкес келеді, ал RC-LH114-W құрамындағы үш ыдыраған UQ мәні 6,2±0,3-тен төмен. Өлшенген 6,2±0,3 мәні (S14-сурет) құрылымда шешілмеген UQ молекулаларының бар екенін көрсетеді.
Псевдо-симметриялық L және M полипептидтерінің әрқайсысында бес TMH бар және бір BChl димерін, екі BChl мономерін, екі бактериофаг (BPh) мономерін және бір гем емес темірді және бір немесе екі UQ10 молекуласын біріктіретін гетеродимер түзеді. Терминалды кетон тобында сутектік байланыстардың болуы және оның Rps-те белгілі жинақталуы арқылы каротиноидтар цис-3,4-дегидрооргодопин деп аталатын M-суббірлігіне енгізіледі. Түрлер (25). RC-H сыртқы мембраналық домені мембранаға бір TMH арқылы бекітілген. Жалпы RC құрылымы туыс түрлердің (мысалы, Rba) үш суббірлігі RC-ге ұқсас. sphaeroides (PDB идентификаторы: 3I4D). BChl және BPh макроциклдері, каротиноидты қаңқа және гем емес темір, сондай-ақ QA орнындағы UQ10 бас тобы және RC-LH116 орнындағы QB хинон (S15-сурет) осы құрылымдардың ажыратымдылық диапазонында қабаттасады.
Әртүрлі QB учаскесінің толтырылу жылдамдығы бар екі RC құрылымының болуы QB хинонының байланысуымен бірге жүретін тұрақты конформациялық өзгерістерді зерттеуге жаңа мүмкіндік береді. RC-LH116 кешенінде QB хиноны толық байланысқан «жақын» күйде орналасқан (26), бірақ RC-LH114-W бөлінуінде QB хиноны болмайды. RC-LH114-W құрамында QB хиноны жоқ, бұл таңқаларлық, себебі кешен белсенді, құрылымдық түрде шешілген QB хиноны бар RC-LH116 кешеніне қарағанда белсендірек. Екі LH1 сақинасы шамамен алты хинонды хелаттағанымен, бесеуі жабық RC-LH116 сақинасында құрылымдық түрде шешіледі, ал ашық RC-LH114-W сақинасында тек үшеуі ғана құрылымдық түрде шектелген. Бұл құрылымдық бұзылыстың күшеюі RC-LH114-W QB учаскелерінің тезірек ауыстырылуын, кешендегі хинон кинетикасының жылдамдауын және LH1 ілмегін кесіп өту ықтималдығының артуын көрсетуі мүмкін. Біз RC-LH114-W RC QB учаскесінде UQ болмауы күрделірек және белсендірек кешеннің нәтижесі болуы мүмкін деп болжаймыз, ал RC-LH114-W QB учаскесі UQ айналымында бірден қатып қалған. Нақты кезең (QB учаскесіне кіру жабылған) бұл белсенділіктің конформациясын көрсетеді.
QB болмаса, L-Phe217-нің UQ10 байланысымен үйлеспейтін позицияға айналуы байқалады, себебі ол құйрықтың бірінші изопрен бірлігімен кеңістіктік соқтығысуды тудырады (6A сурет). Сонымен қатар, айқын негізгі конформациялық өзгерістер айқын, әсіресе L-Phe217 QB байланыс қалтасына ығысқан спираль de (TMH D және E арасындағы ілмектегі қысқа спираль) және L-Tyr223 айналуы (6A сурет) M-Asp45 құрылымымен сутектік байланысты үзу және QB байланыс орнының кіреберісін жабу үшін (6B сурет). Спираль өз негізінде айналады, L-Ser209 Cα 0,33Å-ге ығысады, ал L-Val221Cα 3,52Å-ге ығысады. TMH D және E-де байқалатын өзгерістер жоқ, олар екі құрылымда да қабаттасып жатады (6A сурет). Біздің білуімізше, бұл табиғи RC-дегі QB учаскесін жабатын алғашқы құрылым. Толық (QB-мен байланысқан) құрылыммен салыстыру хинон тотықсызданғанға дейін оның хинонға енуі үшін конформациялық өзгеріс қажет екенін көрсетеді. L-Phe217 хинон бас тобымен π-қабаттасу әрекеттесуін қалыптастыру үшін айналады, ал спираль сыртқа қарай ығысады, бұл L-Gly222 қаңқасы мен L-Tyr223 бүйір тізбегінің тұрақты сутектік байланыс құрылымы бар сутектік байланыс желісін құруына мүмкіндік береді (6-сурет, A және C).
(A) Голограмманың (L тізбегі, қызғылт сары/M тізбегі, қызыл күрең) және апо (сұр) құрылымының қабаттасқан мультфильмі, онда негізгі қалдықтар таяқша тәрізді көрініс түрінде көрсетіледі. UQ10 сары жолақпен көрсетілген. Нүктелі сызық бүкіл құрылымда түзілген сутектік байланыстарды көрсетеді. (B және C) Аполипопротеиннің және бүкіл сақина құрылымының беткі көрінісі, L-Phe217 бүйірлік тізбегінің оттегісін көк түспен және L-Tyr223 қызыл түспен белгілейді. L суббірлігі қызғылт сары түсті; M және H суббірліктері боялмаған. (D және E) Аполипопротеин (D) және тұтас (E) RC QB учаскелері [сәйкесінше (A) бойынша боялады] және Thermophilus thermophilus PSII (жасыл, пластикалық хинонмен көк; PDB ID: 3WU2) Туралаңыз (58).
Күтпеген жерден, LH1 жоқ QB жетіспейтін RC-лердің бірнеше құрылымы қолжетімді болғанымен, осы зерттеуде байқалған конформациялық өзгерістер бұрын хабарланбаған. Оларға Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) және Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29)-дан алынған QB сарқылу құрылымы кіреді, олардың барлығы жалпы QB құрылымымен бірдей дерлік. 3PRC-ны мұқият тексеру LDAO (Лаурилдиметиламин оксиді) жуғыш зат молекулаларының QB позициясының кіреберісінде байланысатынын көрсетті, бұл жабық конформацияға қайта орналасуға кедергі келтіруі мүмкін. LDAO 1EYS немесе 1OGV-де бірдей позицияда ыдырамаса да, бұл RC-лер бірдей жуғыш затты пайдаланып дайындалады және сондықтан бірдей әсер етуі мүмкін. Rba кристалдық құрылымы. Цитохром c2-мен бірлесіп кристалданған Sphaeroides RC (PDB идентификаторы: 1L9B) да жабық QB сайты бар сияқты. Дегенмен, бұл жағдайда RC-M полипептидінің N-терминалды аймағы (Q спираліндегі Tyr қалдығының H байланысы арқылы QB байланыс орнымен әрекеттеседі) табиғи емес конформацияны қабылдайды, ал QB конформациялық өзгерісі одан әрі зерттелмейді (30). RC-LH114-W құрылымында M полипептидінің мұндай деформациясын көрмегеніміз сенімділік тудырады, бұл RC-LH116 RC N-терминалды аймағымен бірдей дерлік. Сондай-ақ, жуғыш зат негізіндегі LH1 антеннасын жоюдан кейін PDB-дегі аполипопротеин RC-лері жойылғанын, бұл RC мен қоршаған LH1 сақинасының ішкі беті арасындағы саңылауда ішкі хинон пулдары мен липидтерді жойғанын атап өткен жөн (31, 32). RC функционалды болып қалады, себебі ол барлық кофакторларды сақтайды, тек ыдырайтын QB хинонынан басқа, ол онша тұрақты емес және дайындау процесінде жиі жоғалады (33). Сонымен қатар, RC-ден LH1 және табиғи циклдік липидтерді алып тастау функцияларға, мысалы, зарядпен бөлінген P+QB-күйінің қызмет ету мерзімінің қысқаруына әсер етуі мүмкін екені белгілі (31, 34, 35). Сондықтан, RC-ді қоршаған жергілікті LH1 сақинасының болуы «жабық» QB орнын сақтап, осылайша QB маңындағы жергілікті ортаны сақтауы мүмкін деп болжаймыз.
Аполипопротеин (QB хинонсыз) және толық құрылым QB учаскесінің айналымының тек екі ғана көрінісін білдірсе де, бірқатар оқиғаларды емес, гидрохинонмен қайта байланысудың алдын алу үшін байланыстыруды тоқтатуға болатындығы туралы белгілер бар. Аполипопротеиннің QB учаскесінің жанында хинолол мен хинонның өзара әрекеттесуі әртүрлі болуы мүмкін, бұл оның RC арқылы қабылданбауына әкеледі. Конформациялық өзгерістер хинондардың байланысуы мен тотықсыздануында рөл атқарады деген болжам ұзақ уақыт бойы айтылып келеді. Мұздатылған RC-лердің қараңғы бейімделуден кейін хинондарды тотықсыздандыру қабілеті бұзылған (36); Рентгендік кристаллография бұл зақым QB хинондарының белсенді проксимальды позициядан шамамен 4,5 Å қашықтықта «дистальды» конформацияда тұрып қалуына байланысты екенін көрсетеді (26), 37). Біз бұл дистальды байланыс конформациясы аполипопротеин мен толық сақиналы құрылым арасындағы аралық күйдің көрінісі деп болжаймыз, ол хинонмен бастапқы өзара әрекеттесуден және QB учаскесінің ашылуынан кейін жүреді.
Белгілі бір фототрофты бактериялар мен цианобактериялардың, балдырлар мен өсімдіктердің PSII кешенінде кездесетін II типті RC құрылымдық және функционалдық консервацияға ие (38). 6-суретте (D және E) көрсетілген құрылымдық туралау PSII RC-лері мен бактериялық RC кешенінің QB учаскесі арасындағы ұқсастықты көрсетеді. Бұл салыстыру хинонмен байланысу және тотықсызданудың тығыз байланысты жүйелерін зерттеу үшін ұзақ уақыт бойы үлгі болып келді. Алдыңғы басылымдарда конформациялық өзгерістер хинондардың PSII тотықсыздануымен қатар жүретіні айтылған (39, 40). Сондықтан, RC-нің эволюциялық сақталуын ескере отырып, бұрын байқалмаған байланыстыру механизмі оттегімен қаныққан фототрофты өсімдіктердегі PSII RC QB учаскесіне де қолданылуы мүмкін.
Rps ΔpufW (белгіленбеген pufW делециясы) және PufW-His (табиғи pufW локусынан экспрессияланған C-терминалды 10x His-белгіленген ақуыз-W) штамдары. palustris CGA009 біздің алдыңғы жұмысымызда (16) сипатталған. Бұл штамдар және изогенді жабайы типті ата-ана PYE (әрқайсысы 5 г литр -1) (LB-де -80 °C температурада сақталған, құрамында 50% (w/v) глицерин) ақуызы, ашытқы сығындысы және сукцинат) агары [1,5% (w/v)] бар пластинаға аз мөлшерде жасушаларды сызу арқылы мұздатқыштан алынды. Пластинка бөлме температурасында анаэробты жағдайда қараңғыда түні бойы инкубацияланды, содан кейін OSRAM 116-W галоген шамдарымен (RS Components, Ұлыбритания) қамтамасыз етілген ақ жарықпен (~50 мкмоль-2 с-1) бір колония пайда болғанша 3-5 күн бойы жарықтандырылды. Бір колония 0,1% (салмақ/көлем) казамин қышқылдарымен (бұдан әрі M22 деп аталады) толықтырылған 10 мл M22+ ортасын (41) егу үшін пайдаланылды. Дақыл оттегісі төмен жағдайда қараңғыда 34°C температурада 180 айн/мин жылдамдықпен 48 сағат бойы шайқап өсірілді, содан кейін 70 мл дақыл сол шарттарда 24 сағат бойы егілді. 30 мл әмбебап бұрандалы мөлдір шыны бөтелкеге ​​30 мл M22 ортасын егу үшін 1 мл көлемі бар жартылай аэробты дақыл қолданылады және стерильді магниттік күшпен араластырғыш таяқшамен 48 сағат бойы араластырумен (~50 мкмольм-2 с-1) сәулелендірілді. Содан кейін 30 мл дақыл сол шарттарда шамамен 1 литр дақылмен егілді, содан кейін ол шамамен 9 литр дақылға 72 сағат бойы ~200 мкмольм-2 с-1 жарықтандырылған дақыл егу үшін пайдаланылды. Жасушалар 7132 RCF температурада 30 минут бойы центрифугалау арқылы жиналды, шамамен 10 мл 20 мМ трис-HCl ерітіндісінде (рН 8,0) қайта ерітілді және қажет болғанша -20°C температурада сақталды.
Еріткеннен кейін, қайта суспензияланған жасушаларға дезоксирибонуклеаза I (Merck, Ұлыбритания) кристалдарын, лизоцимді (Merck, Ұлыбритания) және екі Roche голофермент протеаза ингибиторы таблеткаларын (Merck, Ұлыбритания) қосыңыз. 20 000 psi француз қысымды жасушасында (Aminco, АҚШ) жасушалар 8-12 рет бұзылды. 18 500 RCF температурада 4°C температурада 15 минут бойы центрифугалау арқылы бұзылмаған жасушалар мен ерімейтін қалдықтарды алып тастағаннан кейін, мембрана пигменттелген лизаттан 113 000 RCF температурада 43 000°C температурада 2 сағат бойы центрифугалау арқылы тұндырылды. Еритін фракцияны алып тастап, боялған мембрананы 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) ерітіндісінде қайта суспензиялаңыз және көрінетін агрегаттар болмағанша гомогендеңіз. Аспалы мембрана 2% (w/v) β-DDM бар 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) (Anatrace, АҚШ) ерітіндісінде қараңғыда 4°C температурада 1 сағат бойы ақырын араластыра отырып инкубацияланды. Содан кейін қалдық ерімейтін заттарды кетіру үшін 150 000 RCF-ті 4°C температурада 1 сағат бойы еріту үшін 70°C температурада центрифугалады.
ΔpufW штаммынан алынған еріткіш мембрана үш баған көлемі (CV) байланыстырушы буфері бар [20 мМ трис-HCl (рН 8.0) құрамында 0.03% (w / v) β-DDM бар] 50 мл DEAE Сефароза ион алмасу бағанына қолданылды. Бағанды ​​екі CV байланыстырушы буфермен жуыңыз, содан кейін бағанды ​​50 мМ NaCl бар екі байланыстырушы буфермен жуыңыз. RC-LH116 кешені 1,75 CV-де 150-ден 300 мМ NaCl-ге дейінгі сызықтық градиентпен (байланыстырушы буферде) элюцияланды, ал қалған байланыстырушы кешен 0,5 CV-де 300 мМ NaCl бар байланыстырушы буфермен элюцияланды. 250 және 1000 нм аралығындағы жұтылу спектрін жинаңыз, жұтылу коэффициенті (A880/A280) 1-ден жоғары фракцияны 880-280 нм аралығында сақтаңыз, оны байланыстырушы буферде екі рет сұйылтыңыз және DEAE бағанында тазарту кезінде дәл сол процедураны қайталаңыз. A880/A280 коэффициенттері 1,7-ден жоғары және A880/A805 коэффициенттері 3,0-ден жоғары фракцияларды сұйылтыңыз, ион алмасудың үшінші раундын орындаңыз және A880/A280 коэффициенттері 2,2-ден жоғары және A880/A805 коэффициенттері 5,0-ден жоғары фракцияларды сақтаңыз. Жартылай тазартылған кешен Amicon 100 000 молекулалық салмақты кесу (MWCO) центрифугалық сүзгісінде (Merck, Ұлыбритания) шамамен 2 мл дейін концентрацияланды және 200 мМ NaCl буфері бар Superdex 200 16/600 өлшемді алып тастау бағанына (GE Healthcare, АҚШ) тиелді, содан кейін сол буферде 1,5 CV кезінде элюцияланды. Өлшемді алып тастау фракциясының жұтылу спектрлерін жинап, жұтылу спектрлерін 2,4-тен жоғары A880/A280 және 5,8-ден 100 A880-ге дейінгі A880 қатынастарымен концентрациялаңыз және оларды крио-TEM торын дайындау немесе сақтау үшін дереу пайдаланыңыз. Қажет болғанша -80°C температурада сақтаңыз.
PufW-His штаммынан алынған еріткіш мембрана IMAC буферіндегі (GE Healthcare) 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose бағанына (200 мМ NaCl және 0,03% (салмақ/салмақ) бар 20 мМ трис-HCl (рН 8,0)) қолданылды. v) β-DDM]. Баған бес CV IMAC буферімен, содан кейін 10 мМ гистидині бар бес CV IMAC буферімен жуылды. Негізгі кешен бағаннан 100 мМ гистидині бар бес IMAC буферімен элюцияланды. RC-LH114-W кешенін қамтитын фракция Amicon 100,000 MWCO сүзгісімен (Merck, Ұлыбритания) жабдықталған араластырылған бакқа ~10 мл дейін шоғырландырылады, байланыстырушы буфермен 20 рет сұйылтылады, содан кейін 25 мл қосылады. DEAE Sepharose бағанында буферге байланған төрт CV алдын ала қолданылады. Бағананы төрт CV байланыстыру буферімен жуыңыз, содан кейін кешенді сегіз CV-де 0-ден 100 мМ NaCl сызықтық градиентінде (байланыстыру буферінде) элюциялаңыз, ал қалған төрт CV-де 100 мМ байланыстыру буфері бар. Натрий хлоридінде элюцияланған қалдық кешендер A880/A280 қатынасы 2,4-тен жоғары және A880/A805 қатынасы 4,6-дан жоғары фракциялармен біріктіріліп, Amicon 100,000 MWCO центрифугалық сүзгісінде ~2 мл-ге дейін концентрацияланды және алдын ала 1,5 CV IMAC толтырылды. Буфер Superdex 200 16/600 өлшемді алып тастау бағанымен теңестірілді, содан кейін сол буферде 1,5 CV үстінде элюцияланды. Өлшемді алып тастау фракцияларының жұтылу спектрлерін жинап, жұтылу спектрлерін 2,1-ден асатын A880/A280 және 4,6-дан 100-ге дейінгі A880 қатынастарымен шоғырландырыңыз, олар мұздатылған TEM торын дайындау үшін дереу қолданылады немесе қажет болғанша -80°C температурада сақталады.
Төмен температуралы TEM торларын дайындау үшін Leica EM GP батырмалы мұздатқышы пайдаланылды. Кешен IMAC буферінде A880 50-ге дейін сұйылтылды, содан кейін 5 мкл жаңадан жарық шығаратын QUANTIFOIL 1.2/1.3 көміртекті жабындымен қапталған мыс торына (Agar Scientific, Ұлыбритания) құйылды. Торды 20°C температурада және 60% салыстырмалы ылғалдылықта 30 секунд инкубациялаңыз, содан кейін 3 секунд кептіріңіз, содан кейін -176°C температурада сұйық этанда сөндіру керек.
RC-LH114-W кешенінің деректері 300 кВ үдеу кернеуінде жұмыс істейтін, номиналды үлкейтуі 130 000× және энергиясы 20 эВ болатын Titan Krios микроскопымен eBIC (Электронды биобейнелеу орталығы) (Британдық гауһар жарық көзі) құрылғысына жазылды. Деректерді жинау үшін санау режимінде кескіндерді жазу үшін K2 шыңы детекторы бар Gatan 968 GIF Quantum пайдаланылды. Калибрленген пиксель өлшемі 1,048Å, ал доза жылдамдығы 3,83 e-Å-2s-1. Фильмді 11 секундта жинап, 40 бөлікке бөлдім. Микроскопты қайта фокустау үшін көміртекті аймақты пайдаланыңыз, содан кейін әр тесікке үш фильм жинаңыз. Барлығы 3130 фильм жиналды, дефокустау мәндері -1 және -3 мкм аралығында.
RC-LH116 кешенінің деректері Asterbury Biostructure зертханасында (Лидс университеті, Ұлыбритания) дәл осы микроскопты пайдаланып жиналды. Деректер санау режимінде 130 к үлкейтумен жиналды, ал пиксель өлшемі 4,6 e-Å-2s-1 дозасымен 1,065 Å дейін калибрленді. Фильм 12 секундта жазылып, 48 бөлікке бөлінді. Барлығы 3359 фильм жиналды, дефокустау мәндері -1 мен -3 мкм аралығында болды.
Барлық деректерді өңдеу Relion 3.0 құбырында (42) орындалады. Дозаны өлшеу арқылы сәуле қозғалысын түзету үшін Motioncorr 2 (43) пайдаланыңыз, содан кейін CTF (контраст беру функциясы) параметрін анықтау үшін CTFFIND 4.1 (44) пайдаланыңыз. Осы бастапқы өңдеу кезеңдерінен кейінгі типтік фотомикрографтар 2-суретте көрсетілген. S16. Автоматты таңдау үлгісі 250 пиксельді кадрда және сілтемесіз екі өлшемді (2D) жіктеуде 1000 бөлшектердің шамамен 250 пикселін қолмен таңдау арқылы жасалады, осылайша үлгінің ластануына сәйкес келетін немесе айқын сипаттамалары жоқ жіктеулер қабылданбайды. Содан кейін барлық микрофотосуреттерде автоматты таңдау жүргізілді, ал RC-LH114-W 849 359 бөлшектерді, ал RC-LH116 кешенінде 476 547 бөлшектер болды. Барлық таңдалған бөлшектер екі кезеңнен тұратын 2D жіктеуден өтті, және әрбір кезеңнен кейін көміртегі аймағына сәйкес келетін, үлгінің ластануына, айқын белгілерінің болмауына немесе қатты қабаттасатын бөлшектер қабылданбайды, нәтижесінде 772 033 (90,9%) және 359 678 (75,5%) бөлшектер алынады. RC-LH114-W және RC-LH116 3D жіктеу үшін бөлшектер қолданылады. Бастапқы 3D эталондық моделі стохастикалық градиенттік төмендеу әдісін қолдану арқылы жасалды. Бастапқы модельді эталондық модель ретінде пайдаланып, таңдалған бөлшектер 3D форматында төрт санатқа жіктеледі. Осы санаттағы модельді эталондық модель ретінде пайдаланып, ең үлкен санаттағы бөлшектерді 3D тазартуды орындаңыз, содан кейін еріткіш аймағын жабу үшін бастапқы 15Å төмен жиілікті сүзгіні пайдаланыңыз, жұмсақ жиектерден 6 пиксель қосыңыз және жоғарғы детектордың Gatan K2 шыңының модуляциясын беру функциясын түзету үшін пикселдерді кейіннен өңдеңіз. RC-LH114-W деректер жиынтығы үшін бұл бастапқы модель масканың шетіндегі күшті тығыздықты алып тастау арқылы өзгертілді (UCSF Chimera-дағы негізгі кешен тығыздығынан ажыратылған). Нәтижесінде алынған модельдер (RC-LH114-W және RC-LH116 ажыратымдылықтары сәйкесінше 3,91 және 4,16 Å) 3D жіктеудің екінші кезеңі үшін анықтама ретінде пайдаланылады. Пайдаланылған бөлшектер бастапқы 3D класына топтастырылған және көршілікпен күшті корреляцияны қамтымайды. Айқын құрылымдық ерекшеліктердің қабаттасуы немесе болмауы. 3D жіктеудің екінші кезеңінен кейін ең жоғары ажыратымдылыққа ие санат таңдалды [RC-LH114-W үшін бір санат 377 703 бөлшектен (44,5%) тұрады, RC-LH116 үшін барлығы 260 752 бөлшектен (54,7%) тұратын екі санат бар, мұнда олар бастапқы айналудан кейін аз айырмашылықпен тураланған кезде ғана бірдей болады]. Таңдалған бөлшектер 400 пиксельді қорапта қайта экстракцияланады және 3D тазарту арқылы тазартылады. Еріткіш маскасы бастапқы 15Å төмен жиілікті сүзгіні, 3 пиксельді карта кеңейтімін және 3 пиксельді жұмсақ масканы пайдаланып жасалады. Әрбір бөлшек бойынша CTF тазартуды, әрбір бөлшек бойынша қозғалыс түзетуін және әрбір бөлшек бойынша CTF тазартудың екінші кезеңін қолдана отырып, алынған текстураны одан әрі тазарту үшін әрбір қадамнан кейін 3D тазарту, еріткішті маскалау және кейінгі өңдеу орындалады. FSC (Фурье қабығының корреляция коэффициенті) 0,143 шекті мәнін қолдана отырып, RC-LH114-W және RC-LH116 соңғы модельдерінің ажыратымдылығы сәйкесінше 2,65 және 2,80Å құрайды. Соңғы модельдің FSC қисығы 2-суретте көрсетілген. S17.
Барлық ақуыз тізбектері UniProtKB-дан жүктеледі: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M және RC-H ақуыз тізбектерін және Rba кристалдық құрылымын қамтитын RC гомологиялық моделін құру үшін SWISS-MODEL (45) пайдаланылды. Шаблон ретінде RC пайдаланылды (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera бағдарламасындағы «картаға сәйкестендіру» құралын пайдаланып, жасалған модельді картаға (47) сәйкестендіріңіз, ақуыз құрылымын жақсартыңыз және кофакторды [4×BChlα (мономер кітапханасының қалдығының атауы = BCL), 2×BPhα (BPH), бір немесе екі UQ10 түрін (U10), бір гем емес темірді (Fe) және бір 3,4-дигидрогексакарбонилхолинді (QAK)] қосыңыз, Coot (48). QAK мономер кітапханасында қолжетімді болмағандықтан, ол PHENIX (49) бағдарламасындағы eLBOW құралын пайдаланып параметрленді.
Келесіде LH1 қосалқы бөлігі құрылды. Бастапқыда PHENIX (49)-тағы автоматты құрастыру құралы картаны және LH1-α және LH1-β ақуыз тізбектерін кіріс ретінде пайдаланып, LH1 тізбегінің бір бөлігін автоматты түрде құру үшін пайдаланылды. Ең толық LH1 қосалқы бөлігін таңдап, оны алып тастап, Coot-қа салыңыз, оған жетіспейтін тізбекті қолмен қосыңыз және екі BCl a (BCL) және спириллоксантин (CRT) қоспас бұрын бүкіл құрылымды қолмен нақтылаңыз [тиісті Rps сәйкес LH1 кешенінің тығыздығы және белгілі каротиноидтық құрамы. Түрлер (17)]. LH1 толық қосалқы бөлігін көшіріп, UCSF Chimera «Докинг картасы құралын» пайдаланып, LH1 тығыздығының көршілес модельдік емес аймағына бекітіңіз, содан кейін оны Coot-та нақтылаңыз; барлық LH1 қосалқы бөліктері модельденгенше процесті қайталаңыз. RC-LH114-W құрылымы үшін, Coot-тағы бөлінбеген тығыздықты алу арқылы ақуыз USCF Химера картасындағы қалған ақуыз емес компоненттерден сегменттеледі және бастапқы модельді, ал қалған қосалқы бірліктерді (ақуыз-W) модельдеуді орнату үшін Autobuild құралы қолданылады. PHENIX (49) бағдарламасында. Coot (48) бағдарламасында алынған модельге кез келген жетіспейтін тізбектерді қосыңыз, содан кейін бүкіл қосалқы бірлікті қолмен нақтылаңыз. Қалған бөлінбеген тығыздық липидтердің (CDL = CDL, POPC = 6PL және POPG = PGT PDB мономер кітапханасының идентификаторы), β-DDM жуғыш затының (LMT) және UQ10 молекулаларының (U10) тіркесіміне сәйкес келеді. Модель статистикасы мен сәйкестіктің визуалды сапасы одан әрі жақсартылмайынша, толық бастапқы модельді жетілдіру үшін Coot (48) бағдарламасында PHENIX оңтайландыруын (49) және қолмен оңтайландыруды пайдаланыңыз. Соңында, жергілікті картаны дәлдеу үшін LocScale (50) пайдаланыңыз, содан кейін бөлінбеген тығыздықты модельдеудің және автоматты және қолмен оңтайландырудың бірнеше басқа циклдарын орындаңыз.
Тиісті пептидтер, кофакторлар және басқа липидтер мен хинондар өздерінің тығыздықтарында орналасқан, 1 және 2 суреттерде көрсетілген. S18-ден S23-ке дейін. Соңғы модельдің статистикалық ақпараты S1 кестесінде көрсетілген.
Басқаша көрсетілмесе, УК/Vis/NIR жұтылу спектрлері Cary60 спектрофотометрінде (Agilent, АҚШ) 250 нм-ден 1000 нм-ге дейінгі 1 нм аралықпен және 0,1 с интеграция уақытында жиналды.
Үлгіні A880-ден 1-ге дейін 2 мм жолмен кварц кюветасында сұйылтыңыз және 400 және 1000 нм аралығындағы жұтылу спектрін жинаңыз. Дөңгелек дихроикалық спектрлер Jasco 810 спектрополяриметрінде (Jasco, Жапония) 400 нм және 950 нм аралығындағы 1 нм аралықпен 20 нм мин-1 сканерлеу жылдамдығымен жиналды.
Молярлық сөну коэффициенті негізгі кешенді шамамен 50 A880 дейін сұйылту арқылы анықталады. 10 мкл көлемді 990 мкл байланыстырушы буферде немесе метанолда сұйылтыңыз және BChl ыдырауын азайту үшін сіңіру спектрін дереу жинаңыз. Әрбір метанол үлгісінің BChl мөлшері 54,8 мМ-1 см-1 771 нм-дегі сөну коэффициентімен есептелді және сөну коэффициенті анықталды (51). Өлшенген BChl концентрациясын 32-ге (RC-LH114-W) немесе 36-ға (RC-LH116) бөліп, негізгі кешен концентрациясын анықтаңыз, содан кейін ол буферде жиналған сол үлгінің сіңу спектрін анықтау үшін қолданылады. Өшу коэффициенті. параллель. Әрбір үлгі үшін үш қайталанатын өлшеу жүргізілді және есептеу үшін BChl Qy максимумының орташа сіңуі пайдаланылды. 878 нм толқын ұзындығында өлшенген RC-LH114-W сөну коэффициенті 3280±140 мМ-1 см-1 құрайды, ал 880 нм толқын ұзындығында өлшенген RC-LH116 сөну коэффициенті 3800±30 мМ-1 см-1 құрайды.
UQ10 (52) әдісіне сәйкес сандық анықталды. Қысқаша айтқанда, кері фазалы HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC жүйесін пайдаланып жүргізілді. 0,02% (w/v) темір хлориді бар 50 мкл 50:50 метанол:хлороформда шамамен 0,02 нмоль RC-LH116 немесе RC-LH114-W ерітіңіз және алдын ала теңестірілген Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм ерітіндісін × 25 см бағанға 40°C температурада 1 мл-1 мин-1 ерітіндіде HPLC еріткішінде (80:20 метанол:2-пропанол) ерітіңіз. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидтар) және 780 нм (BChl) толқындарында 1 сағат бойы абсорбцияны бақылау үшін HPLC еріткішінде изократиялық элюцияны орындаңыз. 275 нм хроматограммадағы шың 25,5 минутта интеграцияланды, оның құрамында басқа анықталатын қосылыстар болмады. Интеграцияланған аумақ 0-ден 5,8 нмольге дейінгі таза стандарттарды енгізуден есептелген калибрлеу қисығына сілтеме жасай отырып, UQ10 молярлық мөлшерін есептеу үшін қолданылады (S14 сурет). Әрбір үлгі үш қайталауда талданды, ал көрсетілген қате орташа мәннің SD-не сәйкес келеді.
Құрамында Qy сіңірілуі максималды 0,1 болатын RC-LH1 кешені бар ерітінді 30 мкМ тотықсыздандырылған жылқы жүрегі цитохромы c2 (Merck, Ұлыбритания) және 0-ден 50 мкMUQ2 (Merck, Ұлыбритания) ерітінділерімен дайындалды. Әрбір UQ2 концентрациясында үш 1 мл үлгі дайындалды және өлшеу алдында қараңғылыққа толық бейімделуді қамтамасыз ету үшін қараңғыда 4°C температурада түні бойы инкубацияланды. Ерітінді 300 нм жалын/500 сызықты тормен, 1,24 мм кіріспен, 0,12 мм ортаңғы және 0,6 мм шығыс саңылауларымен жабдықталған OLIS RSM1000 модульдік спектрофотометріне салынды. Қоздыру жарығын болдырмау үшін үлгі фототүтікшесі мен эталондық фотокөбейткіш түтікшесінің кіреберісіне 600 нм ұзындықтағы өткізгіш сүзгі орналастырылған. Жұтылу 0,15 с интеграция уақытымен 550 нм толқын ұзындығында бақыланды. Қоздыру жарығы 880 нм M880F2 жарық диодынан (жарық шығаратын диод) (Thorlabs Ltd., Ұлыбритания) DC2200 контроллері (Thorlabs Ltd., Ұлыбритания) арқылы 90% қарқындылықпен талшықты-оптикалық кабель арқылы шығарылады және жарық көзіне 90° бұрышпен шығарылады. Өлшеу сәулесі үлгімен бастапқыда сіңірілмеген кез келген жарықты қайтару үшін айнаға қарама-қарсы орналасқан. 50 с жарықтану алдында сіңіруді 10 секунд бақылаңыз. Содан кейін хинололдың цитохром c23+ өздігінен тотықсыздану дәрежесін бағалау үшін қараңғыда 60 секунд бойы сіңіруді бақылау жүргізілді (шикі деректер үшін S8 суретін қараңыз).
Деректер 0,5-тен 10 с-қа дейінгі сызықтық бастапқы жылдамдықты орнату (UQ2 концентрациясына байланысты) және әрбір UQ2 концентрациясындағы үш үлгінің жылдамдығын орташалау арқылы өңделді. Тиісті сөну коэффициентімен есептелген RC-LH1 концентрациясы жылдамдықты каталитикалық тиімділікке түрлендіру үшін пайдаланылды, ол Origin Pro 2019 (OriginLab, АҚШ) бағдарламасында көрсетілген және көрінетін Km және Kcat мәндерін анықтау үшін Michaelis-Menten моделіне сәйкестендірілді.
Өтпелі сіңіру өлшеулері үшін RC-LH1 үлгісі 50 мМ натрий аскорбаты (Merck, АҚШ) және 0,4 мМ Тербутин (Merck, АҚШ) бар IMAC буферінде ~2 мкМ дейін сұйылтылды. Аскорбин қышқылы құрбандық электрон доноры ретінде пайдаланылады, ал терт-бутаклофен негізгі RC донорының өлшеу процесінде тотықсызданған күйде қалуын (яғни фотототықсызданбауын) қамтамасыз ету үшін QB ингибиторы ретінде қолданылады. Лазер жолындағы үлгінің қоздыру импульстары арасында қараңғы бейімделу үшін жеткілікті уақытқа ие болуын қамтамасыз ету үшін оптикалық жол ұзындығы 2 мм болатын арнайы айналмалы ұяшыққа (диаметрі шамамен 0,1 м, 350 айн/мин) шамамен 3 мл үлгі қосылады. Үлгіні 880 нм толқын жиілігінде 1 кГц қайталау жылдамдығымен (NIR үшін 20 нДж немесе Vis үшін 100 нДж) қоздыру үшін Ti: Sapphire лазерлік жүйесін (Spectra Physics, АҚШ) күшейту үшін ~100-fs лазерлік импульстерді пайдаланыңыз. Деректерді жинамас бұрын, үлгіні шамамен 30 минут бойы қоздыру жарығына ұшыратыңыз. Әсер ету QA инактивациясына әкеледі (мүмкін, QA бір немесе екі рет төмендетеді). Бірақ бұл процесс қайтымды екенін ескеріңіз, себебі ұзақ уақыт бойы қараңғы бейімделуден кейін RC баяу QA белсенділігіне оралады. Helios спектрометрі (Ultrafast Systems, АҚШ) -10-нан 7000 ps-ке дейінгі кідіріс уақытымен өтпелі спектрлерді өлшеу үшін пайдаланылды. Деректер жиынтықтарын топтастыру, содан кейін біріктіру және стандарттау үшін Surface Xplorer бағдарламалық жасақтамасын (Ultrafast Systems, АҚШ) пайдаланыңыз. Ыдырауға қатысты дифференциалды спектрлерді алу үшін біріктірілген деректер жиынын пайдалану үшін CarpetView бағдарламалық жасақтама пакетін (Light Conversion Ltd., Литва) пайдаланыңыз немесе Origin (OriginLab, АҚШ) бір толқын ұзындығындағы спектрлік эволюцияға сәйкестендіру үшін бірнеше экспоненттерді құралдың реакциясымен біріктіретін функцияны пайдаланыңыз.
Жоғарыда айтылғандай (53), RC және перифериялық LH2 антеннасы жоқ LH1 кешенін қамтитын фотосинтетикалық пленка дайындалды. Мембрана 20 мМ трис (рН 8.0) ерітіндісінде сұйылтылды, содан кейін 2 мм оптикалық жолы бар кварц кюветаға салынды. Үлгіні 540 нм толқын жиілігінде -10-нан 7000 пс-ке дейінгі кідіріс уақытымен қоздыру үшін 30 нДж лазерлік импульс қолданылды. Деректер жиынтығын Rps. pal үлгісі үшін сипатталғандай өңдеңіз.
Мембрана 150 000 RCF температурада 2 сағат бойы 4°C температурада центрифугалау арқылы түйіршіктелді, содан кейін оның 880 нм толқын ұзындығындағы сіңірілуі 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) және 200 мМ NaCl ерітіндісінде қайта суспензияланды. Мембрананы қараңғыда 4°C температурада 1 сағат бойы 2% (w/v) β-DDM ерітіндісінде баяу араластыру арқылы ерітіңіз. Үлгі 100 мМ триэтиламмоний карбонатында (рН 8.0) (TEAB; Merck, Ұлыбритания) 2,5 мг мл-1 ақуыз концентрациясына дейін сұйылтылды (Bio-Rad талдауы). Бұрын жарияланған әдіспен (54) әрі қарай өңдеу жүргізілді, ол 50 мкг ақуызды 1% (w/v) натрий лаураты бар жалпы 50 мкл TEAB ерітіндісіне сұйылтудан басталды (Merck, Ұлыбритания). 60 секунд бойы ультрадыбыстық өңдеуден кейін ол 37°C температурада 30 минут бойы 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфинмен (Merck, Ұлыбритания) тотықсыздандырылды. S-алкилдеу үшін үлгіні 10 мМ метил S-метилтиометансульфонатпен (Merck, Ұлыбритания) инкубациялап, оны бөлме температурасында 10 минут бойы 200 мМ изопропанол ерітіндісінен қосыңыз. Протеолитикалық қорыту 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C қоспасын (Promega UK) қосу және 37°C температурада 3 сағат бойы инкубациялау арқылы жүзеге асырылды. Лаурат беттік белсенді зат 50 мкл этилацетатты және 10 мкл 10% (көлем/көлем) LC класты трифторсірке қышқылын (TFA; Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания) қосу және 60 секунд бойы араластыру арқылы экстракцияланды. Фазаларды бөлу 15 700 RCF кезінде 5 минут бойы центрифугалау арқылы жүзеге асырылды. Өндірушінің хаттамасына сәйкес, пептидті қамтитын төменгі фазаны мұқият сорып алу және тұзсыздандыру үшін C18 спиндік баған (Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания) пайдаланылды. Вакуумдық центрифугалау арқылы кептіргеннен кейін үлгі 0,5% TFA және 3% ацетонитрилде ерітілді, ал 500 нг бұрын сипатталған жүйе параметрлерін қолдана отырып, масс-спектрометриямен біріктірілген нанофлоуинді RP хроматографиясы арқылы талданды.
Rps. palustris proteome дерекқорын іздеу үшін ақуызды анықтау және сандық анықтау үшін MaxQuant v.1.5.3.30 (56) пайдаланыңыз (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Масс-спектрометрия протеомикасының деректері PXD020402 деректер жиынтығы идентификаторы астында PRIDE серіктес репозиторийі (http://proteomecentral.proteomexchange.org) арқылы ProteomeXchange Alliance-ке сақталды.
RPLC арқылы электроспрей ионизациясының масс-спектрометриясымен біріктірілген талдау үшін RC-LH1 кешені жабайы типті Rps-тен дайындалды. Бұрын жарияланған әдісті (16) қолдана отырып, palustris жасушаларында өндірілген ақуыз концентрациясы 20 мМ Hepes (рН 7,8), 100 мМ NaCl және 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad талдауы)) DDM-де 2 мг мл-1 болды. Өндірушінің хаттамасына сәйкес, тұндыру әдісімен 10 мкг ақуызды алу үшін 2D тазарту жинағын (GE Healthcare, АҚШ) пайдаланыңыз және тұнбаны 20 мкл 60% (v/v) құмырсқа қышқылында (FA), 20% (v/v) ацетонитрилде және 20% (v/v) суда ерітіңіз. Бес микролитр RPLC (Dionex RSLC) арқылы масс-спектрометриямен (Maxis UHR-TOF, Bruker) біріктірілген талдау арқылы талданды. 60°C және 100μlmin -1 температурада бөлу үшін MabPac 1.2×100 мм бағанын (Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания) пайдаланыңыз, градиенті 85% (көлем / көлем) еріткіш A [0.1% (көлем / көлем) FA және 0.02% (көлем/ көлем) TFA сулы ерітіндісі] 85% (көлем/ көлем) еріткіш B [90% (көлем/ көлем) ацетонитрил TFA-да 0.1% (көлем/ көлем) FA және 0.02% (көлем/ көлем)] аралығында. Стандартты электроспрей ионизация көзін және әдепкі параметрлерді 60 минуттан астам уақыт бойы пайдаланып, масса-спектрометр 100-ден 2750 м/з-ге дейін (масса-заряд қатынасы) алады. ExPASy биоинформатика ресурс порталы FindPept құралының (https://web.expasy.org/findpept/) көмегімен массалық спектрді кешеннің қосалқы бөліктеріне картаға түсіріңіз.
Жасушалар 100 мл NF-төмен (10μMm-2 s-1), орташа (30μMm-2 s-1) немесе жоғары (300μMm-2 s-1) жарықта 72 сағат бойы өсірілді. M22 ортасы (аммоний сульфаты қосылмаған және натрий сукцинаты натрий ацетатымен ауыстырылған M22 ортасы) 100 мл бұрандалы бөтелкеде (23). Бес 30 секундтық циклде жасушаларды лизиске келтіру үшін 0,1 микронды шыны моншақтар 1:1 көлемдік қатынаста моншақтармен безендіріліп, мұзда 5 минут бойы салқындатылды. Ерімейтін заттар, сынбаған жасушалар және шыны моншақтар үстел үсті микроцентрифугасында 16 000 RCF-те 10 минут бойы центрифугалау арқылы алынып тасталды. Мембрана Ti 70.1 роторында 100 000 RCF бар 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) ерітіндісінде 40/15% (салмақ/салмақ) сахароза градиенті бар 10 сағат бойы бөлінді.
Алдыңғы жұмысымызда сипатталғандай, PufW-дағы His белгісінің иммундық анықталуы (16). Қысқаша айтқанда, тазартылған өзек кешені (11,8 нМ) немесе RC концентрациясы бірдей мембрана (тотығу арқылы анықталады, азайтылған айырмашылық спектрін алып тастап, боялған гельдегі жүктемені сәйкестендіреді) 2x SDS жүктеме буферінде (Merck, Ұлыбритания) екі рет сұйылтылды. Ақуыздар 12% бис-трис NuPage гелінің көшірмесінде бөлінді (Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания). RC-L суббірлігін жүктеу және визуализациялау үшін гель Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Ұлыбритания) бояуымен боялды. Екінші гельдегі ақуыз иммуноанализ үшін метанолмен белсендірілген поливинилиден фторидті (PVDF) мембранаға (Thermo Fisher Scientific, Ұлыбритания) ауыстырылды. PVDF мембранасы 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (көлем/көлем) Tween-20 және 5% (көлем/көлем) майсыздандырылған құрғақ сүтте бітелген, содан кейін анти-His бастапқы антиденесімен (Dlute the antide bufer [50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl және 0.05% (көлем/көлем) Tween-20] 1:1000 A190-114A ерітіндісінде, Bethyl Laboratories, АҚШ) 4 сағат бойы инкубацияланған. Антидене буферінде 5 минут бойы 3 рет жуғаннан кейін, мембрана хрен пероксидазасымен (Sigma-Aldrich, Ұлыбритания) тышқанға қарсы екінші реттік антиденесімен (антидене буферінде 1:10,000 сұйылтылған) біріктірілді. WESTAR ETA C 2.0 хемилюминесценция субстратын (Cyanagen, Италия) және Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Ұлыбритания) пайдаланып анықтауға мүмкіндік беру үшін (антидене буферінде 3 рет жуғаннан кейін 5 минут) инкубацияланды.
ImageJ (57) бағдарламасында әрбір боялған гельдің немесе иммуноанализ жолағының қарқындылық таралуын сызу, шың астындағы ауданды біріктіру және RC-L (боялған гель) мен Protein-W (иммуноанализ) қарқындылық қатынасын есептеу арқылы кескінді өңдеңіз. Бұл қатынастар таза RC-LH114-W үлгісіндегі RC-L мен Protein-W қатынасы 1:1 деп есептеп, барлық деректер жиынтығын тиісінше қалыпқа келтіру арқылы молярлық қатынастарға түрлендірілді.
Осы мақалаға қосымша материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 сайтынан қараңыз.
Бұл Creative Commons Attribution лицензиясының шарттары бойынша таратылатын ашық қолжетімді мақала. Мақала түпнұсқа жұмысқа тиісті сілтеме жасалған жағдайда кез келген құралда шектеусіз пайдалануға, таратуға және көшіруге рұқсат етіледі.
Ескертпе: Біз сізден тек электрондық пошта мекенжайыңызды беруіңізді сұраймыз, сонда сіз парақшаға ұсынған адам сіздің электрондық поштаны көруін қалайтыныңызды және оның спам емес екенін білуі керек. Біз ешқандай электрондық пошта мекенжайларын тіркемейміз.
Бұл сұрақ сіздің келуші екеніңізді тексеру және спамның автоматты түрде жіберілуін болдырмау үшін қолданылады.
Дэвид Дж.К. Свейнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция орталығындағы жарық тұзағы 1 кешенінің жоғары ажыратымдылықтағы құрылымы хинон динамикасына жаңа түсінік береді.
Дэвид Дж.К. Свейнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция орталығындағы жарық тұзағы 1 кешенінің жоғары ажыратымдылықтағы құрылымы хинон динамикасына жаңа түсінік береді.
©2021 Ғылымды дамыту жөніндегі Америка қауымдастығы. барлық құқықтар қорғалған. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef және COUNTER серіктесі болып табылады. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.